一種與特發(fā)性無(wú)精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及男性不育癥檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種與特發(fā)性無(wú)精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo) 記。
【背景技術(shù)】
[0002] 全球約有10%~15%的育齡夫婦面臨不能生育的問(wèn)題，其中一半是由于男性不 育。原發(fā)性無(wú)精子癥是造成男性不育的一個(gè)非常重要的原因，約影響1%的成年男性。男性 不育發(fā)病因素具有復(fù)雜性和多樣性的特點(diǎn)，包括疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂、基因缺陷和 環(huán)境因素等，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但從家族病例報(bào)道和小鼠模型的研究成果中可以 推斷遺傳因素起了很大作用。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已發(fā)現(xiàn)近200 個(gè)基因與男性不育癥的發(fā)生密切相關(guān)；采用基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)近400個(gè)基因與小鼠精子 發(fā)生密切相關(guān)，這些基因的突變、缺失或表達(dá)異常，可能是男性不育癥發(fā)生的重要原因。對(duì) 這些突變基因的研究將有助于男性不育癥的診斷，也有助于將來(lái)在體外受精過(guò)程中防止將 遺傳缺陷帶給下一代。
[0003] 雄激素受體（AR，NCBI Gene ID:367)是一種重要的類固醇激素受體，在男性性分 化和維持正常精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AR屬于核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的類固醇激素作用 的家族。AR有4個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)，包括N末端反式激活結(jié)構(gòu)域（NTD)，DNA結(jié)合域（DBD)，鉸鏈區(qū) (HR)和羧基配體結(jié)合域（LBD)。它能結(jié)合雄激素，包括睪酮⑴和5 α -二氫睪酮（DHT)的 配體結(jié)合域，從而介導(dǎo)核易位和AR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。
[0004] 在過(guò)去的幾年中，確定了一些AR突變或多態(tài)性，可以導(dǎo)致或與遺傳疾病相關(guān)，如 完全或部分雄激素不敏感綜合征（CAIS和PAIS)。然而，還需要深入地研究以揭示AR突變 與特發(fā)性無(wú)精子癥（IA)的關(guān)系，為特發(fā)性無(wú)精子癥的診斷提供依據(jù)和指導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了確定IA患者AR基因突變的情況，我們將776例IA患者和709例正常生育男 性的AR基因外顯子測(cè)序，首次新發(fā)現(xiàn)5個(gè)錯(cuò)義突變和1個(gè)同義突變與IA的發(fā)生相關(guān)。
[0006] 基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種與特發(fā)性無(wú)精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其位 于AR基因的編碼區(qū)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，其中，上述序列的突變位點(diǎn)選自 c. 868T>C、c. 1484G>A、c. 1888C>T、c. 569C>T、c. 616A>G 和 c. 11490T 中的一個(gè)或多個(gè)。
[0007] 前5個(gè)突變位點(diǎn)是錯(cuò)義突變，第6個(gè)突變位點(diǎn)是同義突變。
[0008] 上述突變分別是在如SEQ ID NO: 1所示的AR基因序列的編碼區(qū)的第868位、1484 位、1888 位、569 位、616 位、1279 位和 1149 位。
[0009] 前5個(gè)突變位點(diǎn)依次分別對(duì)應(yīng)的氨基酸變化情況是p. C290R、p. S495N、p. R630W、 p. T190I和p. S206G，即第290位氨基酸由C變?yōu)镽、第495位氨基酸由S變?yōu)镹、第630位 氨基酸由R變?yōu)閃、第190位氨基酸由T變?yōu)镮、第206位氨基酸由S變?yōu)镚。第6個(gè)突變位 點(diǎn)沒(méi)有對(duì)應(yīng)的氨基酸變化。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點(diǎn)選自c.868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T中的一個(gè)或多個(gè)。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點(diǎn)選自c. 18880T。
[0012] 通過(guò)大規(guī)模測(cè)序在特發(fā)性無(wú)精子癥病人中篩選出了 AR基因的6個(gè)新的突變位點(diǎn)， 構(gòu)建AR基因野生型及突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其功能有明 顯差異，表明AR基因的上述突變可能導(dǎo)致特發(fā)性無(wú)精子癥的發(fā)生，從而能夠通過(guò)上述突變 來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育癥（尤其是特發(fā)性無(wú)精子癥）的診斷檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為無(wú)精子癥患者AR基因的3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)測(cè)序圖譜；
[0014] 圖2為無(wú)精子癥患者AR基因的3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)影響的進(jìn)化保守性的氨基酸；
[0015] 圖3為在AR基因上發(fā)現(xiàn)的3個(gè)IA病人特異的錯(cuò)義突變的位置；
[0016] 圖4為3個(gè)AR突變體對(duì)下游靶基因 MMTV表達(dá)的影響，NC表示陰性對(duì)照，WT表示 野生型。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
[0019] 1.1標(biāo)本的收集
[0020] 本申請(qǐng)人從2007年6月到2011年10月共收集1880例無(wú)精子癥病人，其中特發(fā) 性無(wú)精子癥病人為776例，我們的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：1)隨機(jī)檢查三次精液中無(wú)精子；2)生殖系 統(tǒng)或盆腔無(wú)阻塞、炎癥和損傷；3)無(wú)核型異常和Y染色體微缺失，另將709例正常可育男性 (至少育有一個(gè)孩子且未行IVF、ICSI、頂SI等人類輔助生殖技術(shù)）作為對(duì)照進(jìn)行研究。每 例受試者均認(rèn)真簽署知情同意書(shū)，本次研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)。
[0021] 1.2外顯子測(cè)序
[0022] 抽取外周血提取基因組DNA，用枸櫞酸鈉抗凝管收集研究對(duì)象的外周血，迅速置 于-80°C冰箱中備用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血DNA。
[0023] 取出5微克基因組DNA送華大基因研究中心（深圳）進(jìn)行外顯子捕獲、測(cè)序，在特 發(fā)性無(wú)精子癥患者中篩選出AR基因中的9個(gè)突變位點(diǎn)中，其中7個(gè)錯(cuò)義突變和2個(gè)同義突 變，與dbSNP135數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)相比對(duì)，有5種錯(cuò)義突 變和1個(gè)同義突變是我們首次發(fā)現(xiàn)的新突變。
[0024] 1.3驗(yàn)證錯(cuò)義突變
[0025] 以提取的外周血基因組DNA為模板，使用設(shè)計(jì)合成的3對(duì)引物對(duì)僅在特發(fā)性無(wú)精 子癥患者（W320, W691，W530)AR基因存在的3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)（c. 868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，AR序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查得（NCBI Gene ID:367)。引物由 Invitrogen公司合成，所合成的3對(duì)引物對(duì)見(jiàn)表1。
[0026] 表1AR突變位點(diǎn)驗(yàn)證引物
[0027]
[0029] PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性 2min，然后以 98°C 10s、60°C 30s、72°C 45s 進(jìn)行 35 個(gè) 循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0030] DNA電泳：取3 μ 1的PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠孔中，140V電泳，15min，紫外凝膠 成像系統(tǒng)拍照觀察電泳圖，確保單一條帶，其余PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司測(cè)序，引物對(duì) Primerl、Primer2和Primer3擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物片段序列分別如序列表中SEQ ID N0:8、 SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示。
[0031] 1. 4 AR突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0032] 以 pcDNA3. l_AR(Mou L 等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells. BiolReprod. 2013 Aug 15 ;89 (2) : 32.)為模 板，使用設(shè)計(jì)合成的3對(duì)點(diǎn)突變引物，構(gòu)建AR的3種突變體表達(dá)質(zhì)粒。引物由Invitrogen 公司合成，所合成的3對(duì)點(diǎn)突變引物見(jiàn)表2。
[0033] 表2 AR 3對(duì)定點(diǎn)突變引物
[0034]
[0035] 1· 5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
[0036] 1. 5. 1質(zhì)粒準(zhǔn)備
[0037] 野生型 AR 表達(dá)載體：pcDNA3· 1-AR WT (WT 組）
[0038] 突變型 AR 表達(dá)載體：pcDNA3· 1-AR C29〇R (C29〇R 組）
[0039] pcDNA3. 1-AR S495N(S495N 組）
[0040] pcDNA3. 1-AR R630W(R630W 組）
[0041] 1. 5. 2 HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)
[0042] 將HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37°C、5% 0)2和95%濕度條件下 培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞在長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，用〇. 25%胰蛋白酶消化后按比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0043] 1. 5. 3 HeLa細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
[0044] 將HeLa細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法參考轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine? 2000說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染6h后，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔再加入新的1640 培養(yǎng)基500 μ 1，減少Lipofectamine? 2000對(duì)細(xì)胞的毒性。
[0045] 1. 5. 4雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子活性
[0046] 1)轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔加入PBS 1ml洗滌2次；