一種艾里莫芬烷型倍半萜類化合物及其醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從蜘蛛香的干燥根莖中分離得到的一種艾里 莫芬烷型倍半萜類化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜘蛛香（Valeriana wallichii DC.或Valeriana jatamansi Jone)又名馬蹄香、 土細(xì)辛、印度纈草等，系敗醬草科纈草屬植物，植株高20~70cm，根莖粗厚，塊柱狀，節(jié)密，有 濃烈香味。蜘蛛香為多年生草本植物，喜長于海拔2500m以下的山頂草地、灌木林中或溪邊， 在我國主要分布于陜西、河南、湖北、四川、貴州、云南等地。蜘蛛香根莖具有豐富的藥用價(jià) 值，傳統(tǒng)中醫(yī)藥認(rèn)為其具有理氣止痛、消炎止瀉、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)靜安神等功效，可用于治療脘 腹脹痛、消化不良、腹瀉、痢疾、風(fēng)濕痹痛、蛇毒、失眠、肥胖等癥。
[0003] 現(xiàn)代研究表明，蜘蛛香的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油，環(huán)烯醚萜類和黃酮類等。蜘蛛香 的藥用價(jià)值很大一部分歸因于其根和莖所含的豐富揮發(fā)油，其化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要包 括單萜烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物等。
[0004] 現(xiàn)代研究表明蜘蛛香具有抗腫瘤作用、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用、及抗輪狀病毒等 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從蜘蛛香的干燥根莖中分離得到的一種艾里莫芬烷型 倍半萜類化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I):
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將蜘蛛香的干燥根莖粉碎， 用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱 體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃縮 物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、50:1、25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0012] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載 體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0019] 主要材料、試劑來源及儀器類型：
[0020] 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0021 ]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0022] (a)蜘蛛香的干燥根莖（10kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(30L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次）和水飽和的正丁醇 (6LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇 洗脫8個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物（131g);(c)步驟(b)中 70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (8個(gè)柱體積）、50:1 (8個(gè)柱體 積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、10:1 (10個(gè)柱體積)和1:1 (8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(27g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1(8個(gè)柱 體積）、10:1(8個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步 驟(d)中組分2(18g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇 水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I) (230mg)〇
[0023] 結(jié)構(gòu)確證：白色固體;HR-T0F-MS給出的準(zhǔn)分子離子峰m/z 231.1345[M+H] +，表明 化合物分子式為Ci5H18〇2，不飽和度為7,Η-匪R譜（CDC1 3，600MHz)中，H-1 (6.96，d，J = 9.8Hz)，H-2(6.18，d，J = 9.8Hz)，H-4(2.56，q，J = 6.7Hz)，H-6a(1.94，dd，J=12.8,4.6Hz)， H-6b(1.72，t，J=13.7Hz)，H-7(2.36，dd，J=13.8,4.5Hz)，H-9(6.02，s)，H-12a(4.96，d，J = 10.6Hz)，H-12b(4.78，d，J=10.7Hz)，H-13(1.78，s)，H-14(1.12，s)，H-15(1.15，d，J = 6.8Hz);13C-NMR譜（CDC13，150MHz)中，C-l(140.5，CH)，C-2(133.2，CH)，C-3(200.2，C)，C-4 (53.8，CH)，C-5(40.3，C)，C-6(36.8，CH2)，C-7(47.2，CH)，C-8(200.4，C)，C-9(130.3，CH)， C-10(157.8，C)，C-11(145.9，C)，C-12(111.4，CH2)，C-13(21.3，CH3)，C-14(19.4，CH 3)，C-15 (8.7，CH3)。核磁數(shù)據(jù)表明該化合物含有兩組α，β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)[δΗ6.96 (1H，d，J = 9·8Ηζ，Η-1)，6.18(lH，d，J=9.8Hz，H-2)，6.02(lH，s，H-9);SC140.5(C-1)，133.2(C-2)， 200.2(03)，200.4(C-8)，130.3(C-9)和157.8(010)]，一個(gè)異丙烯基結(jié)構(gòu)[δΗ4· 96(lH，d，J = 10.6Hz，H-12a)，4.78(lH，d，J=10.7Hz，H-12b)，1.78(3H，s，H-13) ;SC145.9(C-11)， 111.4(012)和21.3(013)]，兩個(gè)甲基信號(hào)[5!11.12(3!1，8，!1-14)和1.15(3!1，(1，了 = 6.8抱， H-15)JC19.4(C-14)和 8.7(015)]。圓8(：譜中，H-7 與 C-6，C-8 和 C-ll 的相關(guān)性表明 C-7 與異 丙烯基的C-11位相連;Me-14與C-5相關(guān)性表明C-5位連有一個(gè)甲基;Me-15與C-4以及H-4與 C-15的相關(guān)性表明C-15的甲基與C-4位相連。R0ESY譜中，Me-14與Me-15，Me-14與H-7的相關(guān) 性表明Me-14、Me-15和H-7為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān) 類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下式所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論 值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0025]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0026] -、材料和儀器
[0027]本實(shí)驗(yàn)采用人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株，購自美國模式菌種收集中心。 DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化氧、氫氧化鈉、磷酸 氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、甲醇購自南京化工廠?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度 大于98%。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亞諷(DMEM)購自美國Sigma公司;Aimexin-V/PI細(xì) 胞裯亡試劑盒購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、0 · 25%胰蛋白酶、Cell Counting Kit-8試劑盒、青霉素、鏈霉素、Hoechst33258、細(xì)胞核染料DAPI、PMSF、Western blot凝膠配 制試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、5X蛋白質(zhì)變性緩沖液盒、 ECL超敏發(fā)光液、顯影定影試劑盒、X線膠片、硝酸纖維素膜、抗熒光淬滅封片液購自江蘇碧 云天生物研宄所。胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；兔抗人P65抗體購自美國N0VUS 公司；兔抗人Hi stonH3抗體購自美國CST公司；山羊抗兔HRP二抗購自美國SantaCruz公司； 山羊抗兔焚光二抗購自美國EarthOx公司。
[0028] -20°C低溫冰箱(海爾青島），_80°C低溫冰箱(海爾青島），低溫冰箱(海爾青島），高 速離心機(jī)(飛鶴上海），培養(yǎng)皿/板(Coming美國），離心管(Coming美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 美國），倒置顯微鏡(Olympus日本），熒光倒置相差顯微鏡(ZEISS德國），多用途恒溫水浴箱 (躍進(jìn)上海），電子天平儀(上海機(jī)密科學(xué)儀器），超凈工作臺(tái)（ARITECH日本），微量移液器 (Dragon芬蘭），酶標(biāo)儀(Bio-RAD德國），流式細(xì)胞儀(BDAccuriC6美國）。
[0029]二、試驗(yàn)方法
[0030] 1、細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
[0031] 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1 %青霉素、1 %鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37°C，5 %C02培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2天予更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞 融合至80%左右后，吸除培養(yǎng)基，并用預(yù)熱的無菌磷酸酸鹽緩沖液洗3次，然后向培養(yǎng)皿中 加入含0.25%族蛋白酶及0.02%EDTA的細(xì)胞消化液lmL消化約2分鐘，光鏡下觀察細(xì)胞，可 見細(xì)胞逐漸回縮變圓，胞間間隙變寬，此時(shí)移除細(xì)胞消化液，加入完全培養(yǎng)基4mL終止消化， lmL槍頭輕柔吹打制成細(xì)胞懸液，低速離心機(jī)lOOOr