lh、2h、4h、 8h、24h后的大腦、小腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、脊髓等組織器官迅速凍存于液氮，血液在冰 上放置半小時后3500g離心15min取血清于液氮中保存。
[0114] 實施例29.動物組織及血液內(nèi)的酶抑制活性測定
[0115] 取實施例27中約100mg組織精密稱量后加入9倍量(9mL/g)裂解液勻漿。BCA法測定 蛋白濃度后，按照化合物的體外酶抑制活性測定方法，用l〇〇yg蛋白測定FAAH活性，用500yg 蛋白測定NAAA活性。
[0116] 如圖2所示，動物實驗表明，小鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和2.11之后，肝、 脾、肺中的NAAA和FAAH活性被明顯抑制，PEA與AEA含量顯著升高。
[0117] 實施例30.動物組織及血液內(nèi)受試化合物及內(nèi)源性大麻素含量測定
[0118] 精密稱量實施例27中約100mg組織或200yL血清，用含有17:1FAE作為內(nèi)標的甲醇/ 水（1:1，2mL)勾衆(zhòng)。之后加入4mL氯仿充分震蕩萃取后于4°C，3000g離心15min，將下層氯仿 層轉(zhuǎn)入新的離心管中，氮氣吹干后用lmL氯仿重新溶解，取200yL用于測定化合物含量。剩余 氯仿轉(zhuǎn)入硅膠柱，再用lmL氯仿過柱后，搜集氯仿/甲醇(9:l，2mL)洗脫部分，氮氣吹干，100μ L甲醇/氯仿(3:1)重新溶解轉(zhuǎn)入進樣瓶中，HPLC-MS/MS測定PEA、AEA含量。
[0119] 實施例31.佛波酯誘導的耳腫脹模型評價化合物抗炎活性
[0120] 佛波酯(TPA)誘導的耳腫脹模型是醫(yī)學上常見的研究非特異性炎癥的模型。本發(fā) 明采用此模型對化合物的抗炎效果進行評價。取10周齡的昆明小鼠，體重18-22g，雌雄各 半，按體重隨機分為3組:模型對照組、陽性對照組和受試藥物組，每組8只。各組小鼠分別腹 腔注射生理鹽水、布洛芬（3mg/kg)、受試藥物（3mg/kg)。給藥1小時后，將小鼠的右耳涂抹 TPA(20yL)誘導表皮炎癥，左耳做對照。致炎1小時后，處死小鼠，剪下兩耳朵，稱重。
[0121 ]如圖3所示，動物實驗表明，小鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和3.4之后，具有明 顯的抑制炎癥腫脹作用。
[0122] 實施例32.角叉菜膠誘導的大鼠足跖腫脹模型評價化合物抗炎活性
[0123] 角叉菜膠誘導的大鼠足跖腫脹模型是醫(yī)學上常見的研究急性刺激性炎癥的模型。 本發(fā)明采用此模型對化合物的抗炎效果進行評價。取SD大鼠，雌雄各半，按體重隨機分為3 組:模型對照組、陽性對照組和受試藥物組，每組3只。各組小鼠分別腹腔注射生理鹽水、布 洛芬(3mg/kg)、受試藥物(3mg/kg)。給藥1小時后，于大鼠右后足腱膜下注射1 %角叉菜膠致 炎。致炎1小時后，處死大鼠，剪下左右后足，測定容積。
[0124] 如圖4所示，動物實驗表明，大鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和2.11之后，具有 明顯地抑制組織的急性炎癥和腫脹作用。
[0125] 實施例33.弗氏完全佐劑誘導的關(guān)節(jié)炎模型評價化合物抗炎活性
[0126] 弗氏完全佐劑誘導的大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型是醫(yī)學上常見的研究關(guān)節(jié)炎癥的模 型。本發(fā)明采用此模型對化合物的抗炎效果進行評價。取SD大鼠，雌雄各半，每日于每只大 鼠的右后足皮內(nèi)注射O.lmL氟氏完全佐劑，15日左右至關(guān)節(jié)炎完全形成。將造模成功的大鼠 按體重隨機分為3組:模型對照組、陽性對照組和受試藥物組，每組4只，另取4只大鼠作為正 常對照組。于第16日起連續(xù)腹腔注射生理鹽水、布洛芬（3mg/kg)、受試藥物（3mg/kg)，于第 30日檢測繼發(fā)側(cè)足跖容積，計算腫脹程度。
[0127] 如圖5所示，動物實驗表明，大鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和3.12之后，具有 明顯的抑制關(guān)節(jié)炎所帶來的炎癥和繼發(fā)側(cè)足跖腫脹的作用。
[0128] 實施例34.福爾馬林誘導的自發(fā)性疼痛模型評價化合物鎮(zhèn)痛活性
[0129] 福爾馬林誘導的小鼠自發(fā)性疼痛模型是醫(yī)學上常見的研究炎性疼痛的模型。本發(fā) 明采用此模型對化合物的炎性疼痛的治療效果進行評價。取SD大鼠，雌雄各半，按體重隨機 分為3組:模型對照組、陽性對照組和受試藥物組，每組3只。在給以福爾馬林前1小時，各組 小鼠分別腹腔注射生理鹽水、布洛芬(3mg/kg)、受試藥物(3mg/kg)。于小鼠右腿足跖部位注 射福爾馬林(50yL，溶于生理鹽水，濃度為5%)，隨后放入觀察籠，用攝像機記錄隨后1小時 內(nèi)小鼠的行為。疼痛行為學分析統(tǒng)計20分鐘內(nèi)小鼠發(fā)生舔足的次數(shù)。
[0130]如圖6所示，動物實驗表明，大鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和2.11之后，明顯 減少小鼠的舔足的次數(shù)，具有強效的治療炎性疼痛的作用。
[0131] 實施例35.坐骨神經(jīng)分支選擇損傷導致的大鼠神經(jīng)性疼痛模型評價化合物鎮(zhèn)痛活 性
[0132] 坐骨神經(jīng)分支選擇損傷導致的大鼠神經(jīng)性疼痛模型是醫(yī)學上常見的研究神經(jīng)性 疼痛的動物模型。本發(fā)明采用此模型對化合物的神經(jīng)性疼痛的治療效果進行評價。C57BL/6 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，將膝關(guān)節(jié)到臀部一塊備皮消毒，固定后在膝關(guān)節(jié) 部位用手術(shù)刀縱向切割lcm左右，鈍性分離肌肉組織，暴露坐骨神經(jīng)。小心將坐骨神經(jīng)干的 脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支切斷，之后縫合傷口，將大鼠放在干凈的觀察籠內(nèi)。假手術(shù)組只暴露 坐骨神經(jīng)，不切斷腔神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支。實驗前一天及術(shù)后24小時后每天用ugo basile 動態(tài)足底觸覺儀刺激大鼠足底邊緣，自動采集數(shù)據(jù)，獲得大鼠對機械刺激的閾值。測試前 lh，各組大鼠分別腹腔注射生理鹽水、加巴噴丁（3mg/kg)、受試藥物（3mg/kg)。通過比較不 同組的閾值變化來評價化合物對神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效果。
[0133] 如圖7所示，動物實驗表明，大鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和2.11之后，明顯 提高大鼠的抬足的閾值，具有強效的治療神經(jīng)性疼痛的作用。
[0134] 實施例36.硝酸甘油誘導的大鼠頭痛模型評價化合物鎮(zhèn)痛活性
[0135] 硝酸甘油誘導的大鼠頭痛模型是醫(yī)學上常見的研究頭痛的模型。本發(fā)明采用此模 型對化合物的頭痛的治療效果進行評價。選擇實驗大鼠在實驗環(huán)境中自由攝取食物和水 分，適應(yīng)一周。在給以硝酸甘油前1小時，大鼠腹腔注射待評價受試化合物（l-l〇〇mg/kg)，空 白對照為生理鹽水。于大鼠頸部表皮處注射硝酸甘油（l〇mg/kg，溶于生理鹽水，濃度為 5%)，隨后放入觀察籠，用攝像機記錄隨后60分鐘內(nèi)大鼠的行為。疼痛行為學分析統(tǒng)計大鼠 撓頭的次數(shù)。
[0136]如圖8所示，動物實驗表明，大鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和3.4之后，明顯減 少大鼠撓頭的次數(shù)，具有顯著的治療頭痛的作用。
[0137] 實施例37.醋酸誘導的小鼠腹腔疼痛模型評價化合物鎮(zhèn)痛活性
[0138] 醋酸誘導的小鼠腹腔疼痛模型是醫(yī)學上常見的研究內(nèi)臟疼痛的模型。本發(fā)明采用 此模型對化合物的內(nèi)臟疼痛的治療效果進行評價。選擇實驗小鼠在實驗環(huán)境中自由攝取食 物和水分，適應(yīng)一周。在給以醋酸前1小時，各組小鼠分別腹腔注射生理鹽水、FAAH抑制劑 URB597(3mg/kg)、受試藥物（3mg/kg)。于小鼠腹腔注射醋酸（50yL，溶于生理鹽水，濃度為 5%)，隨后放入觀察籠，用攝像機記錄隨后20分鐘內(nèi)小鼠的行為。疼痛行為學分析統(tǒng)計半小 時內(nèi)小鼠發(fā)生扭體的次數(shù)。
[0139]如圖9所示，動物實驗表明，小鼠給予本發(fā)明所述化合物，如2.6和3.12之后，明顯 減少小鼠扭體的次數(shù)，具有顯著的治療內(nèi)臟疼痛的作用。
[0140]附表1部分氨基甲酰尿嘧啶化合物對內(nèi)源性大麻素的抑制作用
[0142] 附表2不同類型的5位取代基對內(nèi)源性大麻素水解酶抑制活性的影響
[0143]
[0144]附表3芳香取代基對內(nèi)源性大麻素水解酶抑制活性的影響

[0147] 附表4不性質(zhì)的A、B片段對內(nèi)源性大麻素水解酶抑制活性的影響
[0148]
[0149] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即 依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種氨基甲酯尿喀晚衍生物，其特征在于:其具有如下結(jié)構(gòu)式：其中 X為R廣、RlCO ( C此）m-、化 OCO ( C出）m-、RlCOO ( C出）m-、RlOCOO (C出）m-、R1R2NCO (C出）m-、 R1R2NCOO ( C出）m-、化 R2NCOO ( C出）m-、化 CON ( C出）m-、化 OCON ( C出）m-、R1R2NCON ( C出）m-或化 R2NCON (CH2)m-，m=0 ~4; Y為-C出-或-CO-; 上述 Rl、R2、R3、R4、R5和R6分別獨立選自面代基、-H、=0、=N0R'、-(C出)nCN、-(C出)nN02、-(C此）nCOOR'、-(CH2)nCONR'2、-(C出）nOR'、-(C此）nSR'、-(CH2)nS0R'、-(C出）nS〇2R'、-(邸2) nNR'2、-(C此)nNR'COR'和-(C此)nNR'S〇2R'，n = 0或1，R'為H或選自含有20個C原子W內(nèi)的各 種取代或未取代的直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基、環(huán)雜烷基、締基、烘基、直鏈雜烷基、支鏈雜 烷基、雜環(huán)烷基、雜締基、雜烘基和芳香基。2. 如權(quán)利要求1所述的一種氨基甲酯尿喀晚衍生物，其特征在于:其具有如下結(jié)構(gòu)式：其中X為-Cl、-Br、-F、-CN、-N02、-OAc、-CH2〇Ac、-OH、-OC出、-OC出邸3、-畑2、-C出或-C此C曲，h = 0~10，A和B分別獨立選自含有10個C原子W內(nèi)的各種取代或未取代的直鏈亞燒 基、支鏈亞烷基、亞環(huán)烷基、亞締基、亞烘基、直鏈亞雜烷基、支鏈亞雜烷基、亞雜環(huán)烷基、亞 雜締基、亞雜烘基和亞芳香基。3. 如權(quán)利要求3所述的一種氨基甲酯尿喀晚衍生物，其特征在于:X為-Cl、-Br、-F、-CN 或-N02，A選自含有10個C原子W內(nèi)的各種取代或未取代的直鏈烷基、支鏈烷基、4. 如權(quán)利要求3所述的一種氨基甲酯尿喀晚衍生物，其特征在于:X為-OAc、-C也Oac或-NHAc, A選自含有10個C原子W內(nèi)的各種取代或未取代的直鏈烷基、支鏈烷基、5. 如權(quán)利要求1所述的一種氨基甲酯尿喀晚衍生物，其特征在于：其結(jié)構(gòu)式為下述之 -* ?6. 權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的氨基甲酯尿喀晚衍生物在制備用于治療疼痛 和炎癥或減輕疼痛和炎癥嚴重性的藥物中的用途。7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于:所述疼痛包括:瘤疹感染后神經(jīng)痛、糖尿病周 圍神經(jīng)病變引發(fā)的疼痛、腫瘤引起的神經(jīng)壓迫和滲出、腰椎手術(shù)失敗綜合癥、腰椎間盤突出 致神經(jīng)性疼痛、產(chǎn)后神經(jīng)痛、=叉神經(jīng)痛、化療誘發(fā)多發(fā)性神經(jīng)疼痛、放療后神經(jīng)從疾病、根 性神經(jīng)疼痛、脊柱硬化引起的壓迫性疼痛、多發(fā)性硬化相關(guān)疼痛、帕金森癥相關(guān)疼痛、癡呆 癥相關(guān)疼痛、中風后疼痛、脊髓損傷后疼痛、骨關(guān)節(jié)疼痛和纖維肌疼痛綜合癥、痛風性關(guān)節(jié) 炎疼痛、類風濕性關(guān)節(jié)炎疼痛、子宮內(nèi)膜移位癥的疼痛、偏頭痛、從集性頭痛、緊張性頭痛綜 合癥、面痛或其他疾病引起的頭痛、闊尾炎、胃炎、膜腺炎、前列腺炎、屯、肌炎、間質(zhì)性膀脫 炎、肝膽腎結(jié)石誘發(fā)的疼痛、腸易激惹綜合癥、慢性骨盆疼痛綜合癥、腰痛、肩膀痛、灼口綜 合癥和復雜性局部疼痛綜合癥。8. 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于:所述炎癥包括:風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié) 炎、哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺病、過敏性鼻炎、牛皮癖、皮炎、肺炎、胃炎、腸炎和脾炎。9. 一種藥物組合物，其特征在于:其有效成分含有權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述 的氨基甲酯尿喀晚衍生物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氨基甲酰尿嘧啶衍生物及其應(yīng)用，其具有如下結(jié)構(gòu)式：本發(fā)明為一類新穎的、具有內(nèi)源性大麻素水解酶抑制作用的化合物，為炎癥和疼痛的治療提供新的方法。
【IPC分類】A61P11/06, A61P11/02, A61P17/00, C07D403/06, A61P11/00, A61P1/04, A61P29/00, A61P1/00, A61P25/02, C07D239/545, A61P17/06, A61P19/02, C07D239/60, C07D239/553, C07D401/06, A61P25/06, A61P25/00, C07D239/557, C07D239/54
【公開號】CN105503741
【申請?zhí)枴緾N201510995494
【發(fā)明人】李宇航, 邱彥, 楊隆河, 任杰, 張洋, 李燕婷, 陳玲, 朱程剛, 盧燦忠
【申請人】廈門稀土材料研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月25日