三聚氰胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法，具體涉及一種三聚氰胺半抗原和抗 原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 三聚氰胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，重要的氮雜環(huán)有機化工原料。簡稱 三胺，俗稱蜜胺、蛋白精，分子式C3N6H6,分子量126. 12。
[0003] 由于三聚氰胺的分子式中含氮量為66%左右，而蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%左 右，因此，由于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作 食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量指標，俗稱"蛋白精"。雖然，目前廣泛認為三 聚氰胺毒性比較低微，但長期攝入仍不容忽視。1994年國際化學品安全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟 委員會合編的《國際化學品安全手冊》第三卷和國際化學品安全卡片說明：長期或反復(fù)大量 攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)石。
[0004] 2011年4月6日，國家五部委發(fā)表聯(lián)合公告，制定我國三聚氰胺在食品中的限量 值。公告規(guī)定：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為lmg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量 值為2. 5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得銷售。這項標準與國際食品法典委員會發(fā)布 的限量一致，而國際食品法典委員發(fā)布的標準被公認為食品領(lǐng)域的國際標準。
[0005] 目前，飼料和食品中三聚氰胺殘留的檢測方法采用儀器分析法和免疫分析法。例 如，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、高效液相色譜法（HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用法 (LC-MS/MS)等。由于三聚氰胺屬于極強性化合物，在色譜柱上幾乎無保留，在進行分析時 一般都要在流動相中加入離子對試劑來改善分離條件，在色譜柱上獲得穩(wěn)定的保留；同時， 由于測定的樣品中一般含有大量蛋白質(zhì)，因此在進行提取時要加入蛋白質(zhì)沉淀劑來除去蛋 白。HPLC法具有定量準確等優(yōu)點，但在檢測時前處理相對復(fù)雜，在實際應(yīng)用中存在方法靈敏 度低等缺點。對于三聚氰胺殘留的確證已有報道的方法有GC-MS和LC-MS/MS。由于三聚 氰胺相對分子質(zhì)量小于150,在進行GC-MS分析時在該質(zhì)量數(shù)附近常用的毛細管氣象色譜 柱柱流失產(chǎn)物的碎片離子很多，對質(zhì)譜有嚴重干擾，因此需對三聚氰胺進行衍生化，降低背 景化學噪音帶來的影響，該方法可進行確證檢測，且靈敏度高，但前處理過程復(fù)雜，需進行 衍生化處理。由于LC-MS/MS法具有靈敏度高、選擇性好、定性定量準確，抗干擾能力強等優(yōu) 點，因此最常作為三聚氰胺殘留檢測的標準法。但該方法也存在前處理過程復(fù)雜，耗時比較 長、成本高等缺點。
[0006] 免疫分析法是以抗原和抗體的特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ)，對動物性食品中藥物 或有害化合物殘留進行定量及半確證的方法。用量子點標記的二抗代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶標二抗建 立的免疫熒光分析方法具有特異性強、穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高、試 劑穩(wěn)定且有效期長（6~18個月）等優(yōu)點，其檢測限比ELISA和理化檢測方法高。樣品中 的三聚氰胺將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入量子點標記的二抗 工作液后，用多功能酶標儀測量微孔溶液的吸光度值，將未知樣品的讀數(shù)和標準品的讀數(shù) 比較，就能得到樣品中的三聚氰胺的濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種三聚氰胺半抗原、抗原的制備方法及其在量子點免疫熒 光試劑盒中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明提供的三聚氰胺半抗原，為式I所示的化合物；
[0009]
[0010] 本發(fā)明還公開了式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟：
[0011] 1 2-氯-4, 6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；
[0012] 2 130mg 4-氨基苯甲酸鈉溶于10ml 0. lmol/L碳酸氫鈉溶液后，緩慢加入上述溶 液，混勻，70°C攪拌反應(yīng)24h ;
[0013] 3 0. lmol/L鹽酸調(diào)pH為6,過濾，固體少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。
[0014] 本發(fā)明提供的三聚氰胺抗原，是將式I所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián) 物。
[0015] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0016] 所述式I所示化合物與BSA偶聯(lián)得到的三聚氰胺抗原的結(jié)構(gòu)見圖1。
[0017] 本發(fā)明還公開了所述三聚氰胺抗原制備的方法，包括如下步驟：
[0018] 1 40mg三聚氰胺半抗原溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，冰浴中加入三正丁 胺38μ 1，攪拌反應(yīng)10min，加入氯甲酸異丁酯22μ 1，室溫反應(yīng)lh ;
[0019] 2 BSAlOOmg溶于10ml 0. lmol/L碳酸鈉溶液，將活化三聚氰胺半抗原溶液逐滴加 入，室溫攪拌過夜，PBS (pH7. 4) 4°C透析72h，期間換透析液6次；
[0020] 3將透析產(chǎn)物在無菌條件下通過0. 2 μ m的濾膜，分裝于安培瓶中，-20度保存。
[0021] 所述三聚氰胺抗原可以作為免疫原制備三聚氰胺特異性抗體，也可以作為包被原 制備量子點免疫熒光微孔板。
[0022] 應(yīng)用三聚氰胺抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0023] 所述三聚氰胺抗原、所述特異性抗體均可應(yīng)用于檢測三聚氰胺。
[0024] 本發(fā)明還公開了應(yīng)用三聚氰胺抗原和三聚氰胺特異性抗體制備得到的量子點免 疫突光試劑盒，包括量子點標記的所述抗體。
[0025] "量子點標記的所述抗體"的制備方法具體如下：
[0026] ①取2. 5mg量子點，用ρΗ4· 7、0· 1M的MES緩沖液洗滌，然后用1ml ρΗ4· 7、0· 1M的 MES 緩沖液重懸，加入 0· 96mg EDC 和 1. 15mg NHS，37°C反應(yīng) 30 分鐘，20000rpm 離心 5min， 收集沉淀，即為活化后的量子點；
[0027] ②取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將 2. 5mg活化后量子點、所述抗體（蛋白質(zhì)含量為0. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液混勻 (總體積為〇· 8ml)，25°C反應(yīng)3. 5小時；
[0028] ③取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質(zhì)量百分含量為5%，37°C反應(yīng)30分鐘， 20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液洗滌，用lml pH7. 4、0. 02M的 PBS緩沖液重懸；
[0029] ④取步驟③得到的液相，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液稀釋至500倍體積。
[0030] 本發(fā)明還保護以上任一所述試劑盒在檢測待測樣本中是否含有三聚氰胺中的應(yīng) 用。
[0031] 本發(fā)明依靠免疫學、免疫化學基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計、合成小分子目 標分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學反應(yīng)，定量的檢測樣品中微量小分子目標分 析物。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測技術(shù) 中對三聚氰胺樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時、且需要大量有機溶劑萃取，以及在檢測過程中要用到 精密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等缺點。本發(fā)明的三聚氰胺抗原，通過免疫動物可 產(chǎn)生了針對三聚氰胺的特異性抗體，用于快速檢測食品中的三聚氰胺殘留，具有操作簡單、 快速，處理樣品量大，靈敏度高，特異性強等諸多優(yōu)點。
【附圖說明】
[0032] 圖1為三聚氰胺半抗原質(zhì)譜圖。
[0033] 圖2為三聚氰胺半抗原核磁共振圖。
[0034] 圖3為三聚氰胺量子點免疫熒光檢測試劑盒標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0035] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為 自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0036] 實施例1、三聚氰胺半抗原的制備與鑒定
[0037] -、三聚氰胺半抗原的制備方法，具