alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法及其在生物樣本中的應(yīng)用
【專利說明】a I Pha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法及其在生物樣本中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法及其在生物樣本中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，針對alpha-酮戊二酸的分析化學(xué)方法主要包括氣相(GC)、高效液相色譜(HPLC)與質(zhì)譜(MS)、紫外檢測器(UV-detector)等。而熒光分子探針檢測方法數(shù)量甚少，包括利用硝基苯并噻二卩坐肼(nitrobenzothiadiazole hydrazine DT)和萘酰亞胺肼取代物(hydrazino-substituted naphthalimide)焚光分子探針對alpha-酮戊二酸進行監(jiān)測。
[0003]色譜檢測方法已經(jīng)在很多領(lǐng)域得以應(yīng)用，但對于臨床醫(yī)學(xué)生物樣本的快速批量檢測來說并不是最好的選擇。其原因在于:首先，技術(shù)步驟復(fù)雜，樣品處理步驟繁多、工作量大、操作時間長、效率低下等。這對于醫(yī)學(xué)生物樣本，特別是活細胞、活體檢測是完全沒有可能實現(xiàn)的。其次，樣品需求量大，試劑消耗量大。生物樣本的特點在于樣本量微小，而色譜聯(lián)合大型儀器檢測的方法則往往需要預(yù)處理較大數(shù)量的待測樣本來達到目標物純化、富集、分離的目的，因此并不適用于微量樣本分析。最后，大型儀器本身成本高，且操作往往步驟縝密，不易于掌握和推廣，在高效率快節(jié)奏的現(xiàn)代社會，此類方法的應(yīng)用似乎達到了發(fā)展的瓶頸期。
[0004]熒光分子探針檢測主要通過設(shè)計熒光分子探針對待測物進行高度選擇檢測，從而產(chǎn)生熒光響應(yīng)的改變，并利用光學(xué)信號的差異性質(zhì)來對待測物進行高靈敏檢測。步驟大體概括為:分子設(shè)計、樣品檢測等?；跓晒夥肿犹结樀臋z測與應(yīng)用是分析技術(shù)中比較新穎的技術(shù)，其原理在于通過分子設(shè)計思想，將發(fā)光基團與反應(yīng)基團連接得到分子探針。檢測時，探針通過反應(yīng)基團的特異性反應(yīng)來識別目標物，分子結(jié)構(gòu)的改變將對發(fā)光基團造成影響，使熒光信號發(fā)生改變，從而實現(xiàn)對目標物的檢測或生物成像。從其檢測原理可見此類方法優(yōu)勢在于選擇性好，不需要待測物分離，操作簡便，適于樣品的批量分析。所以該方法在生命分析研究領(lǐng)域備受推崇。然而，對于alpha-酮戊二酸，此類方法非常少見，說明學(xué)術(shù)界目前的研究程度還遠遠不夠。從目前所報導(dǎo)的兩種方法來看，存在如下缺限:
首先，熒光響應(yīng)差，靈敏度較低，發(fā)光原理不利于生物樣本檢測。從現(xiàn)有報導(dǎo)來看，現(xiàn)有探針與待測物alpha-酮戊二酸反應(yīng)后，熒光增強約7-9倍，很難實現(xiàn)高靈敏檢測。雖然借助添加表面活性劑的方法來實現(xiàn)熒光增強，但這種方法將破壞生物環(huán)境同時會帶來較大的誤差，因而并不適于生物樣本的實際檢測。因此，探針本身的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計有待改進。
[0005]其次，檢測準確性、精確密等指標有待改善。眾所周知，相對于大型儀器較高的信號穩(wěn)定性，生物傳感往往帶來較大誤差。雖然熒光探針的信號自校正功能可有效改善這一缺點。但現(xiàn)有報導(dǎo)并沒有對這一缺點實施改善。并且現(xiàn)有探針分子發(fā)光原理不利于分子熒光的強烈增加。所以，探針的功能性設(shè)計及發(fā)光機理均有待改進。
[0006]再次，檢測的便捷程度仍有待提高。目前，生命有機分析檢測領(lǐng)域中涌現(xiàn)出很多快捷方便的檢測手段，包括比色法、肉眼監(jiān)測等等。這些方法已在細胞分析、活體監(jiān)測等領(lǐng)域廣為使用，但alpha-酮戊二酸的比色/肉眼觀測技術(shù)卻依然處于研究的空白。因此，將檢測方法進一步改善，將實驗操作的便捷程度繼續(xù)提高是alpha-酮戊二酸檢測方法開發(fā)的實際需求。
[0007]最后，缺乏對alpha-酮戊二酸成像技術(shù)的研究。細胞/組織成像技術(shù)是熒光探針優(yōu)勢的獨特體現(xiàn)。該技術(shù)可實現(xiàn)疾病的可視化監(jiān)測與治療，對于癌癥等重大疾病的發(fā)現(xiàn)與診斷有著非凡的意義。但前人所報導(dǎo)的方法中并未涉及這一技術(shù)及應(yīng)用。因而，開發(fā)適于細胞成像的分子探針，建立可視化監(jiān)測平臺將從本質(zhì)上改變alpha-酮戊二酸的研究方式，有望實現(xiàn)對alpha-酮戊二酸所致癌癥疾病的可視化研究。因此，成像技術(shù)及應(yīng)用亟待開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法，制備得到的分子探針可應(yīng)用于生物樣本檢測，具有響應(yīng)性好、數(shù)據(jù)的準確性、重現(xiàn)性、精密度高等優(yōu)點，設(shè)備便捷易操作，可實施性強，特別適合大批量樣本組合篩選等大數(shù)據(jù)研究。
[0009]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
一種alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法，步驟為:將NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazole)溶解于氯仿中，溶解濃度0.002?0.012 g/mL，然后加入體積濃度為0.2?1.2%的水合肼-甲醇溶液，混合均勻，室溫下攪拌得棕色沉淀，過濾，濾餅經(jīng)乙酸乙酯洗滌，烘干，得棕色產(chǎn)物alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針。
[0010]上述制備方法中，所述的NBD-Cl溶解于氯仿中溶解濃度優(yōu)選0.006g/mL;水合肼-甲醇溶液體積濃度優(yōu)選0.6%。
[0011]所述的alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針，檢測效果指標如下:
檢測靈敏度:檢測限0.9pmoL/L;熒光增強倍數(shù)為20?60倍；
吸收波長改變:檢測時吸收向紅光移動100 nm；
顏色變化:在日光燈下顏色由淡綠色變?yōu)榧t色;紫外燈下的顏色由無色變?yōu)榫G色； 雙重定量校正:兼具熒光定量功能及吸收峰比率定量功能；
光學(xué)機理指標:兼具PET熒光開關(guān)功能及吸收紅移功能。
[0012]上述alpha-酮戊二酸的焚光/紫外分子探針的應(yīng)用:適用于生物樣本中alpha-酮戊二酸的定性、定量分析，檢測靈敏、準確、快捷;其中生物樣本主要包括血清、活細胞、肌肉組織等，可應(yīng)用于分析化學(xué)、生命有機分析、疾病預(yù)診及醫(yī)學(xué)臨床檢測等相關(guān)領(lǐng)域。
[0013]本發(fā)明alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針定量分析生物樣本中alpha-酮戊二酸時，適用于檢測血清中alpha-酮戊二酸含量。
[0014]本發(fā)明熒光/紫外分子探針檢測血清中alpha-酮戊二酸含量的方法，步驟包括:
I)配制溶液
探針HNBD儲備液配制:準確稱取alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針溶于無水乙腈，配制濃度為2 X 10—4M的探針HNK)儲備液；
待測目標物alpha-酮戊二酸(α-ΚΑ)儲備液配制:準確稱取待測目標物alpha-酮戊二酸溶于無水乙腈，配制濃度為I X 10—3 M的alpha-酮戊二酸儲備液； 血清儲備液配制:將血清和無水乙腈按體積比5:1混合，轉(zhuǎn)速5000 rpm離心20min，取上清液過0.2 pm膜處理得血清儲備液；
2 )建立血清/a I pha-酮戊二酸標準品的線性方程
取步驟I)配制的待測目標物alpha-酮戊二酸儲備液稀釋得到梯度濃度為2?900μΜ的alpha-酮戊二酸標準品溶液，然后分別取200 yL稀釋后2?900μΜ alpha-酮戊二酸標準品溶液與10yL探針HNBD儲備液和650 血清儲備液混合后，加入50 pL度為10 mM、pH7.4的PBS緩沖液，振搖混合均勻，于37 °C下放置60min，然后經(jīng)熒光分光光度計和紫外光譜儀檢測，建立血清/α-ΚΑ濃度與熒光信號強度的線性方程或血清/α-ΚΑ濃度與紫外吸收信號強度的線性方程；
熒光或紫外方法檢測血清待測樣品中alpha-酮戊二酸含量
a)熒光檢測待測樣品:將1001IL待測樣品注入石英比色皿后，于熒光檢測儀內(nèi)進行掃描檢測，收集熒光發(fā)射位置的強度數(shù)據(jù)代入血清/α-ΚΑ濃度與熒光信號強度的線性方程，計算得alpha-酮戊二酸含量；
b)紫外檢測待測樣品:將1001IL待測樣品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度計，收集最大吸收波長位置的強度，求出反應(yīng)前后最大吸收峰強度比率并代入血清/α-ΚΑ濃度與紫外吸收信號強度，計算得alpha-酮戊二酸含量。
[0015]上述熒光/紫外分子探針檢測血清中alpha-酮戊二酸含量的應(yīng)用，最優(yōu)檢測范圍為熒光3?900μπιΟ1/1，紫外80?200μπιΟ1/1。分別以熒光檢測、紫外檢測的方法對待測物進行平行多次檢測(η=7)，并與標準品進行校準，得到熒光/紫外檢測的最優(yōu)檢測范圍，從而根據(jù)不同樣品所含待測物的濃度范圍來選擇最優(yōu)化的檢測手段進行定量。
[0016]本發(fā)明alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針定性分析生物樣本中alpha-酮戊二酸時，適用于血清樣品中alpha-酮戊二酸的肉眼監(jiān)測、活細胞內(nèi)alpha-酮戊二酸的監(jiān)測和肌肉組織內(nèi)alpha-酮戊二酸的監(jiān)測