一種黑種草皂苷a的制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑種草皂苷A的制備方法，本發(fā)明同時(shí)涉及該化合物物在抗腫瘤 和抗炎功效方面的應(yīng)用，屬保健食品與生物醫(yī)藥領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 毛茛科黑種草屬(Nigella)植物分布在地中海、西亞、中亞、中國(guó)新疆等地，黑種草 子系維吾爾族(維語(yǔ)斯亞旦）和地中海地區(qū)習(xí)用藥材，具有止咳平喘、抗血小板聚集、抗氧 化、抗腫瘤、保肝、降脂、降糖等多種藥理活性，常用于胸悶氣足，乳腫，乳汁減少，耳嗚，熱 淋，石淋，閉經(jīng)等癥。黑種草子中含油30-35%，是維族常用的功能食品;此外，黑種草子中還 富含黃酮、皂苷、生物堿等生物活性物質(zhì)。近年來(lái)，黑種草子中含有的皂苷類(lèi)成分具有一定 的體外抗腫瘤活性，因而對(duì)其研究工作受到關(guān)注。
[0003] 黑種草子現(xiàn)有文獻(xiàn)研究側(cè)重于對(duì)該類(lèi)皂苷類(lèi)成分的分離和鑒定，一般采用醇提、 大孔樹(shù)脂精制、硅膠和反相硅膠多次柱層析純化等復(fù)雜工藝，其分離制備工藝步驟復(fù)雜、得 率低，主要局限于實(shí)驗(yàn)室制備規(guī)模。趙軍等（中國(guó)專(zhuān)利號(hào)CN201010250936.1)公開(kāi)了一種"黑 種草子總苷提取物及其制備方法和應(yīng)用"，所述工藝主要通過(guò)大孔樹(shù)脂精制獲得黑種草子 總苷提取物，其中含有50 %至80 %的皂苷、3 %至11 %的黃酮。劉玉明等（中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?CN201310619087.6)公開(kāi)了"一種從斯亞旦中提取異株五加甲苷的方法"，所述工藝主要通 過(guò)乙醇提取、乙酸乙酯萃取除雜、萃取后水相經(jīng)大孔樹(shù)脂精制獲得異株五加甲苷（即黑種草 皂苷A)提取物(純度范圍57.5%至70.3%)。
[0004] 為進(jìn)一步綜合開(kāi)發(fā)利用黑種草屬植物資源，發(fā)明人對(duì)黑種草子中的化學(xué)成分進(jìn)行 深入研究，從中分離鑒定了生物堿、阜苷等成分[Lian-li Sun，Study on antitubercular constituents from the seeds of Nigella Glandulifera.Chem Pharm Bull,2013,61 (8) :873-876]。黑種草皂苷A是其中的主要成分，又名異株五加甲苷，其化學(xué)名：常春藤皂苷 元-3-〇-[f3_D-吡喃木糖基（l-3)-a-L-鼠李糖基（l-2)-a-L-阿拉伯糖基]-28-0_[a-L-鼠 李糖基（1-4)-β-D-匍糖基-(1-6)-β-D-匍糖苷]。米用優(yōu)選的大孔樹(shù)脂精制工藝，制備獲 得的黑種草總皂苷中，皂苷A含量約為50% [欒明，維藥黑種草子中活性成分HE-III的大孔 樹(shù)脂純化工藝研究，中國(guó)藥學(xué)雜志，2014,49(12) :1014-1017]。
[0005] 通過(guò)深入研究，本發(fā)明首次研制出高純度黑種草皂苷A(含量大于90%)的規(guī)模化 制備工藝，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的高純度黑種草苷A制備工藝。
[0007] 本發(fā)明提供的黑種草皂苷A的制備方法包括以下步驟：
[0008] (1)選取黑種草屬植物種子原料，采用水或醇-水混合溶劑進(jìn)行提取，提取液濃縮， 過(guò)濾，上大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，依次用水、50-80 %乙醇梯度洗脫，收集50-80 %乙醇洗脫液，濃 縮，獲得黑種草總皂苷濃縮液；
[0009] (2)由（1)所得黑種草總皂苷濃縮液，采用加壓制備色譜系統(tǒng)，以20-120μπι粒徑范 圍的碳十八改性硅膠為填料，40-60%甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行分離，收集含有黑種草皂苷A的流 份，濃縮，干燥，即可獲得純度大于90 %的黑種草皂苷A成品。
[0010] 所述工藝步驟（1)中，所述黑種草屬植物可選自腺毛黑種草（Nigella glandul if era)、黑種草(Nigel la damascena)、果黑種草(Nigella sativa)等同屬植物中 的任意一種。黑種草皂苷A在黃花敗醬、異株五加、野木瓜等其它科屬植物中也有發(fā)現(xiàn)，但其 含量在黑種草子中最高。提取溶劑為水、含水乙醇中的任意一種，其中優(yōu)選60-80 %乙醇。所 述大孔樹(shù)脂為苯乙烯系樹(shù)脂，其中優(yōu)選弱極性大孔樹(shù)脂。大孔樹(shù)脂洗脫優(yōu)選60-80%乙醇洗 脫液。根據(jù)需要，大孔樹(shù)脂乙醇洗脫液經(jīng)濃縮后，可進(jìn)一步采用超濾透析和納濾濃縮工序處 理，獲得黑種草總皂苷濃縮液。
[0011]所述工藝步驟(2)中，所述加壓制備色譜系統(tǒng)為低壓或中壓制備色譜，優(yōu)選中壓制 備色譜系統(tǒng)。所述碳十八改性硅膠填料平均粒徑范圍20-120μπι，優(yōu)選40-80μπι。所述流動(dòng)相 優(yōu)選45-55%甲醇范圍；洗脫方式可為等度或梯度洗脫，優(yōu)選等度洗脫。所述含有黑種草皂 苷A的流份采用在線紫外檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為200-210nm。
[0012] 本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)工藝研究，所完成的黑種草皂苷A制備技術(shù)路線有以下特色：（1) 采用優(yōu)選的大孔樹(shù)脂梯度洗脫工藝，結(jié)合超濾透析、納濾濃縮工序，可有效除去黑種草總皂 苷濃縮液中的低分子量黃酮、寡糖等雜質(zhì)，同時(shí)對(duì)濃縮液進(jìn)行過(guò)濾澄清，簡(jiǎn)化了后續(xù)純化工 藝負(fù)擔(dān)；（2)創(chuàng)新性應(yīng)用中壓反相柱色譜工序，可通過(guò)一步制備柱層析獲得高純度黑種草皂 苷A產(chǎn)品，成功實(shí)現(xiàn)了純化工序的自動(dòng)化和生產(chǎn)可行性。本發(fā)明產(chǎn)品純度高，工藝簡(jiǎn)潔、可操 作性強(qiáng)，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化放大。
[0013] 本發(fā)明同時(shí)對(duì)所述黑種草皂苷A的抗腫瘤和抗炎作用進(jìn)行了考察。研究結(jié)果表明， 黑種草阜苷A(80、120mg/kg，i .p .)可顯著抑制SW620人結(jié)腸癌裸鼠的瘤重；黑種草阜苷A (100、200mg/kg)對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓急性炎癥有顯著抑制作用。結(jié)果表明所述黑種草皂 苷A具有明確的抗結(jié)腸癌、抗炎等作用，因而可以應(yīng)用于具有抗腫瘤和抗炎功能的相關(guān)藥物 或保健食品中。
[0014] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
是通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究、工藝優(yōu)化分析完成的，以下述具體實(shí)施例進(jìn)行 說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為采用本發(fā)明實(shí)施例1中提取的步驟(1)黑種草總皂苷樣品HPLC色譜圖。
[0016] 圖2為采用本發(fā)明實(shí)施例1中提取的步驟(2)黑種草皂苷A樣品HPLC色譜圖。
[0017]圖1和圖2中，色譜峰1為黑種草阜苷A。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明所述的黑種草皂苷A是按以下實(shí)施例所表示的方法制造，所涉及到的方法 是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠掌握和運(yùn)用的技術(shù)手段。但以下實(shí)施例不得理解為任何意義上的 對(duì)本領(lǐng)域發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0019] 實(shí)施例1黑種草阜苷A的制備
[0020] 黑種草子藥材購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊(批號(hào):NG20121025)，經(jīng)鑒定為毛 莨科植物腺毛黑種草(Nigella glandulifera Freyn et Sint)的干燥成熟種子。
[0021] 采用HPLC測(cè)定黑種草皂苷A含量，色譜條件：Agilent TC-C18色譜柱（250mmX 4.6mm，5μηι) ;ELSD檢測(cè)；流動(dòng)相為乙腈-水(32:68)等度洗脫20min;流速1.0 mL/min;柱溫40 °C;進(jìn)樣量20yL。大孔樹(shù)脂制備工藝參考欒明報(bào)道進(jìn)行[中國(guó)藥學(xué)雜志，SOH^ashlOH-iOn]。
[0022] (1)取榨油后的黑種草子藥材10kg，加10倍量70%乙醇回流提取3次，每次lh;合并 濾液，減壓回收至無(wú)醇味，用水稀釋至40L，過(guò)濾，上AB-8大孔樹(shù)脂層析柱(柱體積30L/BV)， 先用水洗脫6BV，再用70 %乙醇洗脫4BV，收集70 %乙醇洗脫液，減壓濃縮至12L，其中4L備 用;余下8L濃縮液經(jīng)60°C真空干燥，得黑種草總皂苷143g，HPLC測(cè)定其中黑總草皂苷A含量 為53.5%，即^：色譜圖參見(jiàn)附圖1。
[0023] (2)取黑種草總皂苷濃縮