一種mhc-i類限制性抗腫瘤ctl表位肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域中的一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著對免疫應(yīng)答分子機制研究的深入，現(xiàn)已逐漸認(rèn)識到機體的免疫細(xì)胞 并不是對應(yīng)于各種各樣的病原體或天然抗原的整體分子，而是針對各種各樣抗原分子的抗 原表位，即蛋白質(zhì)抗原是通過其表位來體現(xiàn)其免疫特異性。目前的研究表明，CD8+T細(xì)胞所 識別的靶抗原需先經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理，之后以"抗原肽-MHC-I類分子"復(fù)合物的形式呈現(xiàn) 在抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞表面，相應(yīng)的與MHC-I類分子結(jié)合的抗原肽即為CTL表位。表位肽 能夠激活誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL細(xì)胞，可對人類白細(xì)胞抗原(HLA)配型匹配的腫瘤有一定的殺 傷效果。因此，研究開發(fā)一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽是目前急待解決的新課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，該發(fā)明是對與人主 要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類分子結(jié)合的多肽分子進(jìn)行預(yù)測、篩選和鑒定，提供能與人 MHC-I類分子的結(jié)合位點進(jìn)行結(jié)合、可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞）的表位 肽，從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的，以及所述表位肽在制備用于臨床治療和 檢測腫瘤性疾病疫苗中的用途。
[0004] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，能與人MHC-I 類分子的結(jié)合位點進(jìn)行結(jié)合，可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表位肽，2條表位肽具 有下列氨基酸序列為：
[0005] El,Tyr He Met Phe Val Asp Pro Ser Leu；
[0006] E2,Tyr Leu Val Ala Leu Ser Tyr Thr Leu；
[0007] 所述的與人MHC-I類分子結(jié)合的表位肽，為具有該氨基酸序列的游離型多肽、融合 型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述2種多肽之一為單體的各種形式的聚合體；
[0008] 所述的MHC-I類限制性靶向抗腫瘤CTL表位肽可通過人工合成，或通過原核細(xì)胞或 真核細(xì)胞表達(dá)純化獲得；
[0009] 所述的MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽根據(jù)表位肽與MHC-I類分子相互作用的機 理，預(yù)測獲得表位肽，并根據(jù)其能有效與MHC-I類分子結(jié)合并能激活特異性T淋巴細(xì)胞的特 性鑒定為有效的表位肽，該表位肽長度僅9個氨基酸序列，體外容易合成，方便臨床應(yīng)用；
[0010] 所述的MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽所涉及的表位肽與功能或性質(zhì)已知的蛋 白質(zhì)融合或嵌合，即這些蛋白質(zhì)分子或嵌合分子包含了本發(fā)明涉及的多肽氨基酸序列，具 有這些多肽的相同或相似活性。
[0011] 本發(fā)明的要點在于提供能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點進(jìn)行結(jié)合、可激活特異性 的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞）的表位肽。其基本原理是：首先生物信息學(xué)原理驗證表位 肽與MHC-I類分子的理論結(jié)合能力，并通過計算機模擬聯(lián)合T2親和力實驗進(jìn)一步驗證表位 肽與MHC-I類分子的結(jié)合力;然后通過Fmoc原理合成、HPLC純化表位肽，并通過HPLC-MS分析 其純度和分子量;最終利用DC負(fù)載表位肽誘導(dǎo)CTL細(xì)胞，并通過與不同MHC-I分子表型的腫 瘤靶細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察CTL細(xì)胞免疫殺傷靶細(xì)胞的MHC-I分子的限制性。一種MHC-I類限制 性抗腫瘤CTL表位肽與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有使用計算機模擬技術(shù)與實驗相結(jié)合的方法，進(jìn)一 步提高表位肽篩選的準(zhǔn)確性，多肽物質(zhì)僅為9肽的短肽，體外容易合成，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著 抗腫瘤免疫反應(yīng)，具有非常大的商業(yè)產(chǎn)業(yè)化價值等優(yōu)點，將廣泛的應(yīng)用于腫瘤免疫治療技 術(shù)領(lǐng)域中。
【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0013]圖1為El表位肽的空間結(jié)構(gòu)模擬圖。
[0014]圖2為El表位肽和MHC-I分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖一。
[0015]圖3為El表位肽和MHC-I分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖二。
[0016]圖4為E2表位肽的空間結(jié)構(gòu)模擬圖。
[0017]圖5為E2表位肽和MHC-I分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖一。
[0018]圖6為E2表位肽和MHC-I分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)模擬圖二。
[0019]圖7為El表位肽的質(zhì)譜分析圖。
[0020]圖8為El表位肽的高效液相色譜法分析圖。
[0021]圖9為E2表位肽的質(zhì)譜分析圖。
[0022]圖10為E2表位肽的高效液相色譜法分析圖。
【具體實施方式】
[0023] -種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點進(jìn)行結(jié)合， 可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表位肽，2條表位肽具有下列氨基酸序列為：
[0024] El,Tyr He Met Phe Val Asp Pro Ser Leu；
[0025] E2,Tyr Leu Val Ala Leu Ser Tyr Thr Leu〇
[0026] 所述的與人MHC-I類分子結(jié)合的表位肽，為具有該氨基酸序列的游離型多肽、融合 型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述2種多肽之一為單體的各種形式的聚合體。
[0027] 所述的MHC-I類限制性靶向抗腫瘤CTL表位肽可通過人工合成，或通過原核細(xì)胞或 真核細(xì)胞表達(dá)純化獲得。
[0028]所述的MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽根據(jù)表位肽與MHC-I類分子相互作用的機 理，預(yù)測獲得表位肽，并根據(jù)其能有效與MHC-I類分子結(jié)合并能激活特異性T淋巴細(xì)胞的特 性鑒定為有效的表位肽，該表位肽長度僅9個氨基酸序列，體外容易合成，方便臨床應(yīng)用。
[0029] 所述的MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽所涉及的表位肽與功能或性質(zhì)已知的蛋 白質(zhì)融合或嵌合，即這些蛋白質(zhì)分子或嵌合分子包含了本發(fā)明涉及的多肽氨基酸序列，具 有這些多肽的相同或相似活性。
[0030] 以下實施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實施例僅為了對本發(fā)明加以說明， 本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。
[0031] 實施例一
[0032]表位肽與人MHC-I類分子親和力驗證：
[0033] 1、通過超基序法與量化基序法結(jié)合的方法，驗證本發(fā)明設(shè)計的多肽序列與MHC-I 類分子結(jié)合特性。
[0034] 超基序法是基于在同一人白細(xì)胞抗原(HLA)家族，甚至不同家族的HLA同種異性分 子接納的抗原肽具有相同或相似的錨點殘基構(gòu)成的肽基序，超基序主要作用的錨點殘基是 位于肽鏈2位(P2)氨基酸殘基及羧基末端9位(P9)氨基酸殘基。當(dāng)P2、P9的殘基為A、I、L、M、 V、T時，且第二位為芳香族氨基酸，第九位為疏水性氨基酸，與HLA-A2分子有較高的親和力。 這些氨基酸的特定序列是多肽分子與MHC-I分子結(jié)合的活性位點或關(guān)鍵性氨基酸，決定了 與MHC-I類分子結(jié)合多肽的活性特征。
[0035] 應(yīng)用http://www· syfpeithi ·de/bin/MHCServer ·dll/EpitopePrediction·htm提 供分析軟件對多肽氨基酸序列進(jìn)行超基序法分析。
[0036]量化基序法是基于IBS假設(shè)，即在抗原肽與HLA-A2分子的結(jié)合中，抗原肽的側(cè)鏈效 應(yīng)(錨定、抑制或中性)主要依賴與相應(yīng)的氨基酸殘基在肽中所處的位置受相鄰的氨基酸殘 基影響較小。這在一定的范圍內(nèi)可以假設(shè)在一個多肽序列中，每個氨基酸殘基相互獨立且 影響整個肽與MHC-I類分子的結(jié)合，而該抗原肽的結(jié)合能就是每個位置氨基酸殘基結(jié)合能 的綜合?；谶@種假設(shè)，1993年P(guān)arker等用肽結(jié)合實驗分析154個九肽與HLA-A2分子的親和 力，并得到一個包含180個系數(shù)的結(jié)合矩陣，其中每一個系數(shù)反應(yīng)了相應(yīng)氨基酸殘基在該位 置時的相應(yīng)結(jié)合能。結(jié)合能越大，表位肽與HLA-A2分子結(jié)合越緊密。對于某測定多肽各位置 相應(yīng)氨基酸殘基結(jié)合系數(shù)相乘再乘標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)〇. 151，即為該肽與HLA-A2的結(jié)合力，當(dāng)結(jié)合系 數(shù)大于或等于5時，可以確定為與HLA-A2分子結(jié)合穩(wěn)定，反之認(rèn)定為結(jié)合不穩(wěn)定。根據(jù)上述 原理，應(yīng)用http: //www. bimas . com提供的分析軟件對多肽氨基酸序列進(jìn)行量化基序法分 析。
[0037] 超基序法預(yù)測CTL表位雖然克服了以往采用簡單基序法易產(chǎn)生的假陰性結(jié)果，但 由于此預(yù)測法與基序法具有相同的弱點，即在預(yù)測中僅僅考慮了二、九位殘基的影響而忽 略了其它位點的殘基結(jié)合情況，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，故應(yīng)聯(lián)合量化基序法提高CTI.表位預(yù) 測的準(zhǔn)確性(表1)。表1顯示，超基序法和量化基序法均表明兩條表位肽El和E2與HLA-A2分 子具有很好的結(jié)合能力;表2為20中氨基酸的縮寫表。
[0038] 表1綜合超基序法和量化基序法獲得多肽氨基酸序列與HLA-A2結(jié)合的評分
[0040]表2氨基酸縮寫表
[0041]
[0042] 2、計算機模擬表位肽與人MHC-I類分子的結(jié)合：
[0043] 對上述所得表位肽用ChemOffice軟件包中的ChemDraw Ultra、ChemDraw 3D Ultra分別建立表位肽的二維和三維結(jié)構(gòu)；用MOE軟件對表位肽和和HLA-A2.1的能量和結(jié)構(gòu) 進(jìn)行修飾，模擬二者結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子動力學(xué)結(jié)合模擬和生理活性和運用價值的 預(yù)估，主要包括以下方法：（1)表位肽分子模型構(gòu)建。運用ChemOf f ice軟件包中的ChemDraw Ultra構(gòu)建表位肽分子二維結(jié)構(gòu)，再將表位肽的二維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemDraw 3D Ultra得到三維 模型并保存為M〇12格式，在對接模擬環(huán)節(jié)將三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入MOE軟件中，依次選擇下拉菜單 Compute-Minimize-Molecule，出現(xiàn)Minimize對話框進(jìn)行多肽分子的能級優(yōu)化，使之能級達(dá) 到最小最適合與HLA-A2.1的復(fù)合物進(jìn)行分子對接的能量和結(jié)構(gòu)狀態(tài)，然后將優(yōu)化后的表位 肽導(dǎo)出為M0L2格式，以備和HLA-A2.1的結(jié)合槽凹槽進(jìn)行三維對接。（2)HLA-A2.1