醫(yī)藥級桿菌肽及其制備裝置的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種桿菌肽，更具體地說，它涉及一種醫(yī)藥級桿菌肽及其制備裝置。
【背景技術】
[0002] 桿菌肽(Bacitracin)是一種有效的窄譜多肽抗菌素，其抗菌譜與青霉素類似，對 革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌、螺旋體、放線菌有效。
[0003] 桿菌肽(Bacitracin)，又名枯草菌素、枯草菌肽，其為白色粉末，在水、乙醇、吡啶 中易溶，酸性或中性的桿菌肽水溶液相對較穩(wěn)定，pH值5-7的溶液可穩(wěn)定4周，在pH大于9的 溶液中存在時，室溫下可迅速降解。研究發(fā)現(xiàn)，桿菌肽為多種氨基酸結合而成的不穩(wěn)定的多 肽，含A、A1、B、0"G等多種組分，且其以桿菌肽A為主。目前公認桿菌肽A、B1和B2組分最具有 生物活性，其含有約桿菌肽混合物95 %的生物活性。桿菌肽A的分子式為C66Hiq3N17O16S，其為 一個十二肽，含有一個七元環(huán)。桿菌肽A含有一個由帶-SH異亮氨酸的羧酸和半胖氨酸的-NH 2縮合形成的不尋常的噻唑鄰環(huán)，一個在賴氨酸的ε _順2側(cè)鏈和天門酰胺的C-端之間連接 形成的環(huán)狀七肽結構，以及四個D-氨基酸包括D-谷氨酸、D-鳥氨酸、D-苯丙氨酸和D-天門冬 氨酸，其結構式如式I所示：
[0004] 目前，桿菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵法制備，其以枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtil is)和B類地衣芽抱桿菌(Baci Ilus Iicheniformis)發(fā)酵液為原料來提 取分離制得。國內(nèi)目前的桿菌肽產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，且其以飼料級為主，其與中國藥典中對 藥用級桿菌肽的質(zhì)量標準相比仍具有相當?shù)牟罹唷Ｆ渲校袊幍鋵λ幱玫臈U菌肽的質(zhì)量 標準見表1。 表1中國藥典(2015)中桿菌肽質(zhì)量標準
[0005] 美國專利US2498165公開了一種利用有機溶劑萃取桿菌肽的方法，這種方法利用 水、正丁酯之間的不互溶性、桿菌肽及其雜質(zhì)在不同溶劑中的溶解度差異來萃取桿菌肽，這 種方法需要使用大量的溶劑且在成品中的溶劑殘留難除去，且其收率低。
[0006][0007] 因此，開發(fā)出一種適用于多種原料來源的藥用級的桿菌肽具有較大的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于多種原料來源的醫(yī) 藥級桿菌肽，其制備方法包括如下步驟： Sl，取桿菌肽發(fā)酵液進行酸化，經(jīng)陶瓷膜過濾，得到陶瓷膜透出液； S2,將Sl的陶瓷膜透出液經(jīng)陽離子交換層析，收集陽離子交換層析上柱液； S3，將S2的陽離子交換層析上柱液經(jīng)陰離子交換，收集陰離子交換上柱液； S4，將S3的陰離子交換上柱液經(jīng)金屬螯合，收集金屬螯合柱液； S5,將S4的金屬螯合柱液經(jīng)納濾處理，得到末次納濾產(chǎn)品液； S6，將S5的末次納濾產(chǎn)品液溶解，并將溶解的末次納濾產(chǎn)品液過濾處理，取其濾液進行 干燥、粉碎處理，即得醫(yī)藥級桿菌肽； 其中，Sl中的桿菌肽發(fā)酵液可用低含量的桿菌肽溶液代替； 所述末次納濾處理的納濾膜的截留分子量為300Da-500Da。
[0009] 桿菌肽發(fā)酵液或低含量的桿菌肽溶液中含有目標桿菌肽、其他多肽類物質(zhì)、糖類、 色素和多種代謝產(chǎn)物等，其混合物中雜質(zhì)較多較難分離。將桿菌肽發(fā)酵液或低含量的桿菌 肽溶液，先經(jīng)酸化處理，除了能保證桿菌肽的正?；钚?，還能除去一些堿性菌，同時能將體 系內(nèi)的桿菌肽的物質(zhì)完全溶解在發(fā)酵液的溶液中；將經(jīng)酸化的桿菌肽發(fā)酵液或低含量的桿 菌肽溶液通過陶瓷膜過濾，一方面能除去一些大顆粒的物質(zhì)，同時陶瓷膜的分離作用有利 于將部分大分子的多肽或其他大分子物和桿菌肽分離，陶瓷膜還能吸附發(fā)酵液中的色素， 有利于對桿菌肽發(fā)酵液或低含量的桿菌肽溶液進行初步的提純，同時還能保護后續(xù)過程中 的色譜柱;將陶瓷膜透出液依次進行陽離子交換層析、陰離子交換，有利于提高桿菌肽A這 類兩性化合物的純度和含量;將陰離子交換上柱液經(jīng)金屬螯合再經(jīng)納濾處理，有利于除去 發(fā)酵液中的重金屬含量，有利于保證產(chǎn)品的安全性，使之符合藥用標準;將末次納濾產(chǎn)品液 溶解，并將溶解的末次納濾產(chǎn)品液過濾處理，重結晶再次除雜;通過上述多重的除雜過程， 其起到了較好的提純的組合效果，得到的桿菌肽符合藥用標準，且其不受發(fā)酵液來源的限 制，其具有較好的大生產(chǎn)化價值。
[0010] 作為優(yōu)選，所述Sl中，陶瓷膜為活性氧化鋁或氧化鋯;所述陶瓷膜的孔徑為0.1-I.0um〇
[0011] 活性氧化鋁或氧化鋯均成非對稱膜結構，當桿菌肽發(fā)酵液通過其時，其能通過其 非對稱膜結構進行提純，有利于桿菌肽(桿菌肽A的分子量為1000-2000)這類低分子物質(zhì)的 通過而阻止高分子量多肽等的通過。
[0012] 作為優(yōu)選，所述S2中，陽離子交換層析中使用的陽離子交換層析柱為BPG100/500， 其陽離子交換層析的柱填料為Capto Sp impres，所述洗脫液為0.1-2.5M的NaCl水溶液和 pH=3 · 0-5 · 5 的NaAc-HAc 緩沖溶液； 所述S3中，陰離子交換中使用的陰離子交換柱為BPG140/500,其陰離子交換的柱填料 為Capto Q impreso
[0013] 通過Capto Sp impres的強陽離子交換，其在洗脫液為0.1-2.5M的NaCl水溶液和 pH=3.0-5.5的NaAc-HAc緩沖溶液時具有較好的洗脫作用，有利于將產(chǎn)品和雜質(zhì)有效的分 離，同時還能溶解析出部分雜質(zhì)有利于提純，當NaCl水溶液和NaAc-HAc緩沖溶液的體積用 量比為1:50-200時其提純的效果最佳;通過Capto Q impres的強陰離子交換，雜質(zhì)被陰離 子交換樹脂吸附，從而提高通過陰離子交換樹脂后的樣品的純度和含量。
[0014]作為優(yōu)選，所述S2中，所述收集陽離子交換層析上柱液的過程中，根據(jù)其洗脫時間 來收集陽離子交換層析后的目標產(chǎn)品液、目標產(chǎn)品和雜質(zhì)的混合液、雜質(zhì)液;取所述陽離子 交換層析后的目標產(chǎn)品和雜質(zhì)的混合液經(jīng)第一次納濾處理，將納濾處理后的濾液和陽離子 交換層析后的目標產(chǎn)品液合并即為陽離子交換層析上柱液;所述第一次納濾處理的納濾膜 的截留分子量為300Da-500Da。
[0015] 根據(jù)洗脫時間來判斷目標產(chǎn)品和雜質(zhì)的流出，直觀方便，有利于控制產(chǎn)品的最終 質(zhì)量;對目標產(chǎn)品和雜質(zhì)的混合液進行納濾處理，有利于在保證產(chǎn)品純度和含量的同時提 尚廣品的收率。
[0016] 作為優(yōu)選，所述S3中，所述收集陰離子交換上柱液的過程中，先直接收集經(jīng)陰離子 交換后的目標產(chǎn)品液;再取所述陰離子交換后的目標產(chǎn)品液，先成鹽使其目標產(chǎn)品和雜質(zhì) 發(fā)生共沉淀，再將共沉淀物溶解，即為陰離子交換上柱液;所述第二次納濾處理的納濾膜的 截留分子量為300Da-500Da。
[0017] 對陰離子交換后的目標產(chǎn)品液(含有部分和目標產(chǎn)品的結構相似的雜質(zhì)），先成鹽 使其目標產(chǎn)品和雜質(zhì)發(fā)生共沉淀，使目標產(chǎn)品和雜質(zhì)特別是和目標產(chǎn)品相似的物質(zhì)析出， 這些與目標產(chǎn)品相似的物質(zhì)的結構和性能均與目標產(chǎn)品相似，其較難除去，但當其成鹽后， 目標產(chǎn)品的鹽和目標產(chǎn)品相似物的鹽性質(zhì)之間相差相對較大，兩者比重差和溶解度等會有 所加大，因此當再共沉淀物溶解的過程中，目標產(chǎn)品是完全溶解而其相似物是只能溶解極 少量，因此通過該法再經(jīng)過納濾處理后的樣品能基本除去與其結構相似的物質(zhì)，提高分離 的效果。
[0018] 作為優(yōu)選，所述陰離子交換后的目標產(chǎn)品和雜質(zhì)的混合液的成鹽過程中，添加的 物質(zhì)選自草酸或硫酸鋅或氯化鋅中的至少一種;所述共沉淀物溶解的過程中，添加的物質(zhì) 為氨水或氫氧化鈉水溶液。
[0019] 研究發(fā)現(xiàn)，桿菌肽的草酸或鋅鹽與其相似物的草酸或鋅鹽的性質(zhì)相差較大，其容 易分離;桿菌肽的草酸或鋅鹽與其相似物的草酸或鋅鹽，添加氨水和氫氧化鈉水溶液的過 程總，其目標產(chǎn)品是完全溶解而其相似物是只能溶解極少量，因此能提高產(chǎn)品的含量和純 度;且桿菌肽及其雜質(zhì)與草酸或鋅鹽的反應可逆、無毒無害。
[0020] 作為優(yōu)選，所述S4中，金屬螯合前，先將S3得到的陰離子交換上柱液經(jīng)堿液處理至 pH為7.0-7.5;所述收集金屬螯合柱液的過程中，通過金屬螯合的液體經(jīng)超濾后的濾液，即 為金屬螯合柱液;所述超濾中，超濾膜的截留分子量為300Da-500Da。
[0021] 金屬螯合前，先將S3得到的陰離子交換上柱液經(jīng)堿液處理至pH為7.0-7.5，一方面 能保證金屬螯合的效果，另一方面還能提高其分離效果，還能保證產(chǎn)品的品質(zhì);將金屬螯合 的液體超濾，能快速除去金屬螯合中產(chǎn)生的雜質(zhì)，進一步提高分離效果。
[0022] 作為優(yōu)選，所述S6中，將納濾產(chǎn)品液溶解使用的溶劑為乙醇或水或其混合物;所述 過濾處理包括通過依次設置的0.45μπι過濾器過濾和0.22μπι過濾器過濾;所述干燥為冷凍干 燥，所述冷凍干燥的溫度為-20°C_5°C;所述粉碎處理后的醫(yī)藥級桿菌肽的顆粒大小< IOy