一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵元素是大多數(shù)生物有機(jī)體進(jìn)行新陳代謝所必須的元素之一，它在維持細(xì)胞生長代謝過程中起到重要的作用。鐵蛋白是一類廣泛存在于動(dòng)植物、微生物細(xì)胞內(nèi)的用來維持鐵代謝平衡的重要蛋白。
[0003]大腸桿菌鐵蛋白結(jié)構(gòu)呈球形，由鐵核和蛋白殼兩部分組成，前者以氫氧化鐵和磷酸鹽的形式存在于蛋白殼，后者是由24個(gè)亞基單體組成的八面體高度對(duì)稱性結(jié)構(gòu)。鐵蛋白外徑12nm，內(nèi)徑約8nm，由于其獨(dú)特的納米級(jí)立體空間結(jié)構(gòu)，其在藥物載體以及納米結(jié)構(gòu)材料設(shè)計(jì)等方面已成為研究熱點(diǎn)。大腸桿菌鐵蛋白的血紅素分子存在于二相對(duì)稱軸的相鄰亞基之間，距離蛋白殼外表面10埃，血紅素的卟啉環(huán)與二相對(duì)稱軸平行，對(duì)稱的兩個(gè)亞基上的Met52從卟啉環(huán)兩側(cè)與卟啉環(huán)的鐵配位絡(luò)合。血紅素參與了蛋白的鐵存儲(chǔ)和釋放過程中的電子傳遞，是細(xì)菌鐵蛋白的電子隧道組成之一 1^52被認(rèn)為是大腸桿菌鐵蛋白與血紅素結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，但將其突變?yōu)楸彼崆野l(fā)現(xiàn)其對(duì)鐵蛋白穩(wěn)定性影響至今未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系，所得突變體具有可調(diào)控的溫度穩(wěn)定性，可作為一種通過小分子誘導(dǎo)控制溫度穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)納米載體。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其DNA序列如SEQ NO:1所示。
[0007]上述的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，為定點(diǎn)突變，是將第52位蛋氨酸突變?yōu)楸彼帷?br>[0008]上述去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其氨基酸序列如SEQN0:2所示。
[0009]用于擴(kuò)增去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體的引物對(duì)為:
[0010]上游引物:5，-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3，
[0011 ]下游引物:5 ’ -GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3 ’。
[0012]上述去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體的純化方法包括順序相接的如下步驟:
[0013](I)挑取含重組質(zhì)粒pET32 Ek/LIC_M52A的大腸桿菌搖菌培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)至OD6qq達(dá)到
0.6，30°(3下用終濃度0.5111]\1 IPTG 誘導(dǎo) 3h;
[0014](2)離心收集菌體并洗滌；
[0015](3)用N1-NTA親和柱純化:向洗滌后的菌體中加入I XBinding Buffer重懸菌體，超聲破碎菌液后離心，然后取離心液通過0.22μπι水系膜過濾后上樣，用1mM咪唑洗脫去除雜蛋白，最后用15mM咪唑洗脫液收集目標(biāo)蛋白洗脫，最后在25°C溫度下用2U/yL腸激酶酶切20h，即可獲得目標(biāo)蛋白。
[0016]上述PET32Ek/LIC為載體，M52A為去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體。
[0017]上述去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體恢復(fù)穩(wěn)定性的化學(xué)誘導(dǎo)方法為:將血紅素與去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體以摩爾比1:10均勻混合，在25°C下誘導(dǎo)36h。
[0018]大腸桿菌細(xì)菌鐵蛋白由24個(gè)亞基單體組成，該鐵蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性高(熔點(diǎn)1?為69.9°C)，亞基之間以C4、C3和C2形式高度對(duì)稱、精密排列，其中處在C2對(duì)稱性上每兩個(gè)亞基即存在一個(gè)血紅素分子，血紅素是一種鐵卟啉化合物，申請(qǐng)人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，去除血紅素雖然對(duì)鐵蛋白的自組裝沒有明顯影響，但是對(duì)其熱穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響，其Tm值54.3°C遠(yuǎn)小于野生型鐵蛋白1^值69.9°C，且經(jīng)過氯化血紅素與該突變體M52A化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)合后，發(fā)現(xiàn)其1?值重新恢復(fù)至67.7°C，由此可知，突變體M52A對(duì)大腸桿菌鐵蛋白穩(wěn)定性影響很大，且血紅素具有調(diào)控鐵蛋白穩(wěn)定性的作用。
[0019]一種重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO:1所示的DNA序列;所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。
[0020]本發(fā)明未提及的技術(shù)均參照現(xiàn)有技術(shù)。
[0021]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體(M52A突變體)具有降低蛋白穩(wěn)定性和可化學(xué)誘導(dǎo)重新獲得蛋白穩(wěn)定性的特性，其四級(jí)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯變化，仍為球形殼狀結(jié)構(gòu);野生型鐵蛋白Tm(50%蛋白質(zhì)發(fā)生變性的溫度)為69.9°C，而突變體M52A的Tm僅為54.3°C，與氯化血紅素化學(xué)誘導(dǎo)后其Tm恢復(fù)為67.7°C，因此該突變體具有溫度穩(wěn)定性可調(diào)控性；由于鐵蛋白已被廣泛應(yīng)用于納米材料的載體，此突變體M52A不影響蛋白的聚合度，且仍形成24聚體殼狀結(jié)構(gòu)，因此仍可作為載體應(yīng)用于納米材料的合成;其顯著優(yōu)點(diǎn)在于可通過加入小分子化合物氯化血紅素使鐵蛋白溫度穩(wěn)定性提高，可應(yīng)用于溫敏性材料的合成。
【附圖說明】
[0022]圖1是PET32Ek/LIC_M52A的瓊脂糖凝膠核酸電泳圖；
[0023]圖2是M52A的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
[0024]圖3是M52A和M52A+Hemin在25°C下圓二色譜掃描圖；
[0025]圖4是M52A和M52A+Hemin在200-600nm范圍內(nèi)的紫外可見掃描圖；
[0026]圖5是野生型鐵蛋白、突變體M52A以及M52A+Hemin的熱穩(wěn)定性比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0028]實(shí)施例1
[0029]大腸桿菌鐵蛋白突變基因M52A的制備方法:
[0030]以含有野生型大腸桿菌鐵蛋白基因的質(zhì)粒pET32Ek/LIC為模板，通過常規(guī)PCR的方法可得到含有點(diǎn)突變M52A的基因序列(引物采用實(shí)施例2的引物)。
[0031]大腸桿菌鐵蛋白突變體M52A基因序列如SEQ NO:1所示。
[0032]實(shí)施例2
[0033]大腸桿菌鐵蛋白基因M52A的克隆:
[0034]用下述一對(duì)引物PCR擴(kuò)增實(shí)施例1中的大腸桿菌鐵蛋白基因:
[0035]上游引物:5，-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3，
[0036]下游引物:5，-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’
[0037]PCR反應(yīng)體系:IyL合成序列(實(shí)施例1所得)，IyL上游引物，IyL下游引物，10yL5 XPrimeSTARTMBuffer,32.5yL ddH20,4yL dNTP,0.5yL PrimeSTARTMHS DNA聚合酶。
[0038]PCR 反應(yīng)條件:95°C5min ； 95°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 4.5min，30 個(gè)循環(huán);72°(3延伸10111；[11 ； 4°C 保溫。
[0039]實(shí)施例3
[0040]重組克隆、表達(dá)載體pET32 Ek/LIC-M52A(實(shí)施例2所得)的驗(yàn)證:
[0041]將PCR產(chǎn)物(實(shí)施例2制備)進(jìn)行瓊脂糖凝膠驗(yàn)證:制備10%瓊脂糖凝膠，加入核酸染料至終濃度為0.5yg/mL，將5yL DNA樣品與IyL 6 XLoading Buffer混勻，小心加入加樣孔中，同時(shí)加入 DL 10000或 I kb ladder Marker0
[0042]設(shè)定100?120V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)前沿跑至距凝膠正極端約Icm左右時(shí)停止電泳。如圖1所示，在7000bp處有明顯的條帶，與目的片段理論大小一致，說明此基因已被成功克隆。
[0043]實(shí)施例4
[0044]PET32 Ek/LIC-M52A(實(shí)施例2所得)重組質(zhì)粒的去模板、純化、磷酸化及自身環(huán)化:
[0045]構(gòu)建反向PCR產(chǎn)物去模板反應(yīng)體系(50yL):44yL反向PCR產(chǎn)物(實(shí)施例2所得)，5yLDpnI Buffer1IyL DpnI，置于37°C水浴4h。
[0046]為降低產(chǎn)物濃度，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化(B10MIGA，上海)。
[0047]DNA濃縮后進(jìn)行磷酸化反應(yīng):8yL PCR純化產(chǎn)物；IyL T4 LigaselOXbuffer; IyLT4Polynuc