改進的β胸腺素片段的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請是申請?zhí)枮?00980117938.9，申請日為2009年3月13日，發(fā)明名稱為"改進 的β胸腺素片段"的中國專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求于2008年7月25日提交的美國臨時申請No.61/083,798和2008年3月17 日提交的美國臨時申請No. 61 /037，207的優(yōu)先權(quán)，所述申請的全文內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及β胸腺素片段的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0005] 胸腺素 M最初被鑒定為在體外內(nèi)皮細胞的迀移和分化中上調(diào)的蛋白質(zhì)。胸腺素 β4 (TM)最初由胸腺分離，是被鑒定為在各種組織中普遍存在的43個氨基酸的4.9kDa多肽?，F(xiàn) 已描述了此蛋白的多種功能，包括在內(nèi)皮細胞分化和迀移、T細胞分化、肌動蛋白扣押 (sequestration)和血管形成中的功能。
[0006] 美國專利第4,297,276號公開了TM的氨基酸序列，該專利通過引用并入本文。編 碼TM的基因在進化中高度保守。實際上，小鼠、大鼠和人TM之間存在著總體同源性(total homology)?；趯θ甤DNA文庫的分析，預(yù)期犬和人TM之間存在總體同源性。
[0007] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TM存在于哺乳動物的多種組織類型中，并且還參與大量的細胞和生理 學(xué)進程，包括誘導(dǎo)骨髓細胞的末端核苷脫酰轉(zhuǎn)移酶活性，刺激下丘腦促黃體生成素釋放激 素和促黃體生成素的分泌，抑制迀移并增強巨噬細胞的抗原提呈，和在體外誘導(dǎo)T細胞系的 表型變化。
[0008] 本領(lǐng)域中需要活性β-胸腺素片段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 根據(jù)一個實施方式，具有對應(yīng)于胸腺素 M、胸腺素 mo和/或胸腺素 β15氨基酸序列 的一部分的氨基酸序列的肽片段包含以下序列、基本由以下序列組成或由以下序列組成： 氨基酉愛序列H-Leu-Ly s-Ly s-Thr-Gl u-Thr、H-Ser-Asp-Ly s-Pro、Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser、H-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-GIn、GlU-Lys-Asn-Pr〇-Leu-Pr〇-Ser-Lys-Glu-Thr、Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser、 Met-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser、Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr、Ser-Asp-Lys_Pr〇-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-GlruSer-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-LysNLeu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-I I e-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser、所述片段的其中所述蛋氨酸是氧 化或超氧化的含蛋氨酸變體、所述片段的正常(normally)為含蛋氨酸但具有取代所述正常 含蛋氨酸片段的至少一個蛋氨酸的氨基酸取代基的變體、所述片段的分離的R-對映體、所 述片段的分離的S-對映體或其組合。
【具體實施方式】
[0010]可通過任何適合的方法，例如通過固相肽合成的方法，提供本發(fā)明的β-胸腺素片 段，美國專利Ν〇.5,512,656中公開了固相肽合成的一個實例。
[0011] 現(xiàn)已鑒定出很多TM異構(gòu)體，并且與TM的已知氨基酸序列具有約70%，或約75%， 或約80%或更高的同源性。此類異構(gòu)體包括，例如Τβ4^、Τβ9、Τβ10、Τβ11、Τβ12、Τβ13、Τβ14 和Τβ15。與TM類似，發(fā)現(xiàn)ΤβΙΟ和Τβ15的異構(gòu)體使肌動蛋白扣押。TM及其很多異構(gòu)體都具有 氨基酸序列LKKTET或LKKTNT，其看起來參與介導(dǎo)肌動蛋白扣押或結(jié)合。
[0012] 根據(jù)一個實施方式，提供了肽片段，其具有對應(yīng)于胸腺素 M、胸腺素 mo和/或胸腺 素 β15氨基酸序列的一部分的氨基酸序列，所述肽片段包含以下序列、基本由以下序列組成 或由以下序列組成：氨基酸序列H-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr、H-Ser-Asp-Lys-Pro、Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser、H-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln、Glu-Lys-Asn-Pr〇-Leu-Pr〇-Ser-Lys-Glu_Thr、Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser、Met-Ala-Glu_IIe-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys_Ser、Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr、Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln、Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys、Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser、所述片段的其 中所述蛋氨酸是氧化或超氧化的含蛋氨酸變體、所述片段的正常為含蛋氨酸但具有取代所 述正常含蛋氨酸片段的至少一個蛋氨酸的氨基酸取代基的變體、所述片段的分離的R-對映 體、所述片段的分離的S-對映體或其組合。所述片段正常含蛋氨酸的變體可對應(yīng)于含蛋氨 酸片段，但具有取代所述片段是至少一個蛋氨酸的氨基酸取代基。在本文中無論何時表示 為氨基酸Met時，應(yīng)理解所述Met可被氨基酸AAA取代，其中AAA可包括用于取代所述蛋氨酸 的亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或脯氨酸等。
[0013] 很多β胸腺素肽及其片段在其氨基酸序列中包含在體內(nèi)和體外遭受氧化的氨基酸 蛋氨酸。在很多已知的胸腺素中，蛋氨酸出現(xiàn)在第6位。
[0014] 由氨基酸蛋氨酸(C5HnNO2S)氧化為蛋氨酸亞砜(C5HnNO 3S)或其他代表了含蛋氨酸 的β-胸腺素，例如TM及其片段的主要降解途徑。
[0015] 在第6位包含蛋氨酸的β-胸腺素的實例包括TM、TMala、TMxen、T09 met、Tm(^T0 13。
[0016] 在優(yōu)選的實施方式中，用于取代蛋氨酸的氨基酸是中性、非極性、疏水性和/或非 氧化性的。
[0017] 這些組合物的優(yōu)點在于穩(wěn)定性高于含蛋氨酸β-胸腺素，同時具有與對應(yīng)的β-胸腺 素片段基本相同或不同的活性。
[0018]在優(yōu)選的實施方式中，用于取代蛋氨酸的氨基酸抑制β_胸腺素片段的氧化，且最 優(yōu)選取代后胸腺素片段的生物活性與對應(yīng)的含蛋氨酸胸腺素片段的生物活性基本相 同。
[0019] 取代含蛋氨酸β-胸腺素肽片段中的蛋氨酸可導(dǎo)致所述肽穩(wěn)定性特征(profile)的 變化和/或所述肽片段的意料不到的新性質(zhì)或沒有變化的性質(zhì)。
[0020] 作為非限定性的實施例，用于取代含蛋氨酸β-胸腺素片段中的蛋氨酸的氨基酸為 纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸。
[0021] 根據(jù)一個實施方式，用于取代含蛋氨酸β-胸腺素片段中的蛋氨酸的氨基酸不是亮 氨酸。在某些實施方式中，用于取代含蛋氨酸β-胸腺素片段中的蛋氨酸的氨基酸為纈氨酸、 異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或脯氨酸。
[0022] 根據(jù)一個實施方式，用于取代蛋氨酸的優(yōu)選氨基酸是纈氨酸或異亮氨酸。
[0023] 根據(jù)另一個實施方式，用于取代蛋氨酸的優(yōu)選氨基酸是丙氨酸。
[0024] 根據(jù)另一個實施方式，用于取代蛋氨酸的優(yōu)選氨基酸是纈氨酸。
[0025] 可通過任何適合的方法例如通過固相肽合成方法提供本發(fā)明的β-胸腺素片段及 其變體，美國專利No. 5，512，656中公開了固相肽合成的一個實例。
[0026] PCT公開號WO 2006/076523 Al公開了顯示Met被取代的β-胸腺素肽的活性的測試 結(jié)果。
[0027]本發(fā)明還可應(yīng)用于本文公開的片段的組合，所述組合可通過將兩種或多種不同片 段混合(物理混合)而形成，或者通過使用任何適合的連接方法將兩種或多種不同片段化學(xué) 連接而形成。
[0028] 根據(jù)一個實施方式，所述片段包含氨基酸序列Ac-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-〇H。 [0029] 根據(jù)一個實施方式，所述片段包含氨基酸序列H-Ser-Asp-Lys-Pro-OH。
[0030] 根據(jù)一個實施方式，所述片段包含氨基酸序列H-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-〇H 〇
[0031 ] 根據(jù)一個實施方式，所述片段包含氨基酸序列八(3-361'-八8口-1^8-?1'〇-八8口-]\^七-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-〇H 〇
[0032] 根據(jù)一個實施方式，所述片段包含氨基酸序列H-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH0
[0033] 根據(jù)一個實施方式，所述片段包含氨基酸序列H-Glu-Lys-Asn-Pr