一種重組人成纖維細(xì)胞生長因子21融合蛋白的表達(dá)和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種重組人成纖維細(xì)胞生長因子21融合蛋 白的表達(dá)和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)2011年WHO統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病患者已達(dá)3.66億，且每年均有460萬人死于此??； 2012年"中國慢病監(jiān)測及糖尿病專題調(diào)查"報(bào)告結(jié)果顯示，中國已有9700萬的糖尿病患者， 其中T2DM患者約占了95%，并且呈逐年增加趨勢。目前還沒有確切有效的治療方法可治愈 該病，臨床上使用的胰島素、噻唑烷二酮等藥物均未達(dá)到標(biāo)本兼治的目的，根據(jù)給藥時(shí)間點(diǎn) 只具有短期的降血糖作用，不能滿足機(jī)體的生理節(jié)律性調(diào)節(jié)機(jī)制，而且對肝腎功能有一定 的損傷作用。因此，繼續(xù)尋找安全有效的治療藥物和方法仍然是當(dāng)今急待解決的問題。
[0003] 成纖維細(xì)胞生長因子21 (Fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是成纖維細(xì)胞生 長因子家族的新成員，是Nishimura等首次在小鼠胚胎組織中分離鑒定獲得。大量研究表 明，F(xiàn)GF21是一種特異性作用于肝臟、胰島和脂肪組織的新型糖脂代謝調(diào)控因子，具有降低 血脂、血糖、改善胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能的作用，在機(jī)體的糖脂代謝中具有重要作用。 FGF21是FGFs家族成員中目前發(fā)現(xiàn)的唯一沒有促有絲分裂的基因，從而很大程度上降低了 臨床用藥的潛在風(fēng)險(xiǎn)。正是由于FGF21在糖脂代謝中具有獨(dú)特的生物學(xué)功能和藥理特性，成 為了治療T2DM和代謝綜合征的一個(gè)很有希望的治療靶點(diǎn)。目前，F(xiàn)GF21的研究焦點(diǎn)主要在糖 尿病為主的代謝病，在糖尿病和肥胖動(dòng)物模型的研究中顯示出較好的抗糖尿病的特點(diǎn)，同 時(shí)可以使飲食引起肥胖的小鼠的代謝恢復(fù)正常，對于脂肪肝、肥胖和2型糖尿病具有較強(qiáng)的 治療潛力。因此有國外學(xué)者預(yù)言，F(xiàn)GF21有望替代胰島素成為治療糖尿病和肥胖病的一代新 藥，隨之也成為了近年研究的一個(gè)熱點(diǎn)，然而FGF21基因工程蛋白藥物的研究具有重要的現(xiàn) 實(shí)意義。
[0004] 根據(jù)報(bào)道目前表達(dá)該蛋白的系統(tǒng)有SUMO系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)等，SUMO系統(tǒng)表達(dá)該蛋白 是用His標(biāo)簽的親和層析進(jìn)行融合蛋白純化，酵母系統(tǒng)表達(dá)該蛋白是用離子交換柱層析進(jìn) 行蛋白純化，用以上的方法進(jìn)行純化后不僅蛋白損失大純度也不高等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)方便、產(chǎn)量較高純度高的制備重組人成纖維細(xì)胞生 長因子21融合蛋白的表達(dá)和純化方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] 一種含有重組人成纖維細(xì)胞生長因子21融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1， 編碼該融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
[0008] 以上SEQ ID NO: 1包括GST蛋白的氨基酸序列和重組人成纖維細(xì)胞生長因子21的 氨基酸序列（SEQ ID NO:3)。
[0009] 以上SEQ ID NO: 1包括GST蛋白的核苷酸序列和重組人成纖維細(xì)胞生長因子21的 核苷酸序列（SEQ ID NO:4)。
[0010] SEQ ID NO:4的獲得方式為以Pl為上游引物，P2為下游引物，以人肝臟細(xì)胞cDNA為 模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得出的核苷酸序列。
[0011] 所述上游引物Pl的序列為SEQ ID N0:5,所述下游引物P2的序列為SEQ ID N0:6。
[0012] -種包含SEQ ID NO: 2的基因，以限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I為酶切位點(diǎn)，對 SEQ ID N0:4的序列進(jìn)行酶切，插入到含有EcoR I和BamH I的載體中。
[0013] -種對以上融合蛋白的表達(dá)方法:將含有SEQ ID N0:2的序列構(gòu)建到載體中，然后 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21形成工程菌株，工程菌于37°C恒溫振蕩箱至OD值為0.3時(shí)，加 lmol/L IPTG 5μ1，開始搖菌誘導(dǎo)表達(dá)。
[0014]以上誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為6個(gè)小時(shí)。
[0015]對以上表達(dá)蛋白的純化方法：
[0016] (I )ΡΗ值為8.0的PB緩沖液使菌體重懸，用超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎30min，超聲破 碎時(shí)菌液應(yīng)保持低溫2-8°C;
[0017] (2)超聲破碎后菌體沉淀加預(yù)冷l%Triton IOml左右使菌體重懸，超聲破碎lmin， 4°C放置30min，4°C7000rpm離心15min，進(jìn)行雜蛋白洗滌；
[0018] (3)沉淀分別用lmol/L、2mol/L、4mol/L尿素進(jìn)行洗滌，4°C7000rpm離心15min后收 集沉淀;沉淀用8mol/L尿素溶解，4°C放置過夜。
[0019] (4)蛋白復(fù)復(fù)性:測定8mol/L尿素溶解的蛋白濃度后，用PB緩沖液將蛋白溶液液稀 釋至終濃度為l〇〇μg/ml，4°C放置過夜。
[0020] (5)選用4FF膠裝離子交換Q柱進(jìn)行純化；
[0021] (6)GST親和柱純化。
[0022] 一種含有以上融合蛋白的藥物。
[0023]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:選用GST系統(tǒng)表達(dá)hFGF21蛋白，通過誘導(dǎo)條件的 優(yōu)化大幅度提高了蛋白表達(dá)量;經(jīng)過離子交換柱層析純化和GST親和柱二次純化，不僅可盡 量減小蛋白的損失，還可有效提尚蛋白純度;對hFGF21蛋白的成藥性開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí) 意義。
【附圖說明】
[0024] 圖 1 是重組質(zhì)粒PGEX-5X-1-hFGF21 酶切鑒定圖。M:DL 2000DNA marker
[0025] I:重組質(zhì)粒PGEX-5X-1-hFGF21酶切產(chǎn)物，從上到下亮帶分別為質(zhì)粒PGEX-5X-1，目 的基因 hFGF21560bp。
[0026] 圖2是融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)鑒定SDS-PAGE圖。從右到左分別為蛋白Marker、0h菌體 蛋白、2h菌體蛋白、4h菌體蛋白和6h菌體蛋白。
[0027]圖3是融合蛋白的大量表達(dá)鑒定SDS-PAGE圖。從左到右分別為蛋白Marker、0h菌體 蛋白和6h菌體蛋白。
[0028]圖4是包涵體處理和蛋白復(fù)性的結(jié)果。1、菌體超聲后的沉淀，2、l%Triton洗后包 涵體，3、Imol/L尿素洗后包涵體，4、2mol/L尿素洗后包涵體，5、4mol/L尿素洗后包涵體，6、 8mol/L尿素溶解后的蛋白溶液，7、稀釋復(fù)性后的蛋白溶液
[0029] 圖5 Q柱離子交換層析純化的穿透峰和洗脫峰。
[0030] 圖6是離子交換層析純化后的融合蛋白（1、2均為純化后樣品）。
[0031] 圖7 GST親和柱二次純化的洗脫峰。
[0032] 圖8 GST親和柱二次純化后融合蛋白（1、2均為二次純化后樣品）。
[0033] 圖9 WB鑒定hFGF21融合蛋白結(jié)果（1、空載體誘導(dǎo)后的總蛋白，2、二次純化后的融 合蛋白）。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 構(gòu)建pGEX-5X-l的hFGF21基因重組質(zhì)粒
[0036] 1.1 PCR獲取hFGF21成熟肽目的片段
[0037]以人肝臟細(xì)胞cDNA為模板加上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系:模板、上下游引物 各lyl，PCR master mix 12·5μ1，Η20 9.5yl;PCR條件：94°C 10min，94°C 30s、52°C 30s、72 °(3 1111；[1135個(gè)循環(huán)，72°07111；[11，4°(3 12111；[11，？0?產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠鑒定并回收。
[0038] I · 2載體PGEX-5X-1-hFGF21 的構(gòu)建
[0039] I · 2 · I質(zhì)粒PGEX-5X-1和目的片段hFGF21連接
[0040] (1)先對質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)酶切，酶切體系：PGEX-5X-1質(zhì)粒5μ1，10χ Quik Cut Green Buffer 2μ1，限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I各 1μ1，Η20 llyl;hFGF21 PCR產(chǎn)物 片段 12μ1，10χ Quik Cut Green Buffer 2μ1，限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I各 1μ1，Η20 4μ I;酶切條件:水浴37°C 15-30min，然后分別回收。
[0041 ] (2)連接體系：目的片段 15μ1，質(zhì)粒 1μ1，10χ T4Buffer 2·5μ1，Τ4連接酶 1μ1，Η20 5.5μ1;條件：16°C放置16小時(shí)。
[0042] 1.2.2.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
[0043] (1)取_80°C凍存DH5a感受態(tài)細(xì)胞一支冰上融化，加入連接產(chǎn)物PGEX-5X-l_hFGF21 重組質(zhì)粒輕柔混勻，冰水浴45min;
[0044] (2)42°C 水浴 90s，冰水浴 2min;
[0045] (3)加入無選擇性LB培養(yǎng)基800μ1，37°C250rpm恒溫振蕩30min;
[0046] (4)無菌操作取200μ1左右菌液接種于氨芐抗性固體培養(yǎng)基，涂板，培養(yǎng)皿正放培 養(yǎng)箱約30min后倒置，過夜培養(yǎng)。
[0047] 1.2.3.質(zhì)粒的提取
[0048] (1)對平板PGEX-5X-1-hFGF21DH5a挑選單克隆菌于5ml加氨芐（1:1000)5μ1的滅菌 LB液體培養(yǎng)基中，37°C250rpm恒溫過夜搖菌；
[0049] (2)每5ml菌液全部收集于1.5ml離心管，室溫8000x g離心2min;
[0050] (3)菌體沉淀加250μ1 Buffer pi移液槍吸打使菌體重懸再加 ΙμL visual Lyes振 蕩混勻，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象；
[0051 ] (4)加250μ1 Buffer p2,立即溫和顛倒離心管混勻，室溫靜置4min，溶液應(yīng)呈均勻 的藍(lán)色；
[0052] (5)加350μ1 Buffer p3,立即溫和顛倒離心管充分混勻，溶液有藍(lán)色變?yōu)闊o色并 伴有大量絮狀沉淀，室溫靜置2min;
[0053] (6)12000x g離心10min，上清小心移入吸附柱，9000x g離心30s，棄去收集管中廢 液，吸附柱放回收集管；
[0054] (7)吸附柱中加入去蛋白液Buffer DWl 500μ1，9000χ g離心30s，棄去收集管中廢 液，吸附柱放回收集管；
[0055] (8)吸附柱中加入500μ1 Wash solution，9000x g離心30s，棄去收集管中廢液，吸 附柱放回收集管，重復(fù)一次；
[0056] (9)將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)9000x g離心2min;
[0057] (10)將吸附柱放到滅菌1.5ml離心管中，在吸附膜中央加 50μ1 Elution Buffer， 室溫靜置2min，9000x g離心Imin，所得質(zhì)粒DNA溶液-20°C保存?zhèn)溆?[0058] (11)取樣適量用于測序。
[0059] 1.2.4.酶切和測序鑒定
[0060] (1)酶切體系：重組質(zhì)粒5μ1，10χ Quik Cut Green Buffer ΙμL，限制性內(nèi)切酶 EcoR I和BamH I各0·5μ1，Η20μ1，*10μ1。
[0061] (2)酶切條件:37°C 水浴 15-30min;
[0062 ] (