一種深海來源羧酸酯酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種深海沉積物來源簇酸醋酶、其編碼基因 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂類水解酶包括簇酸醋酶化C3.1.1.1)和脂肪酶化C3.1.1.3)，廣泛存在于微生物 中，能夠催化醋類化合物的水解和合成。簇酸醋酶主要催化少于10個(gè)碳的短鏈酷基甘油，月旨 肪酶主要催化大于10個(gè)碳的長鏈酷基甘油。脂類水解酶具有許多優(yōu)良特性，如催化反應(yīng)不 需要輔助因子，手型選擇特異性高，擁有較廣的底物譜，W及在有機(jī)溶劑中保持高穩(wěn)定性 等。脂類水解酶是工業(yè)生產(chǎn)中重要的催化劑，可廣泛應(yīng)用于手性藥物催化、皮革絹紡原料脫 月旨、廢水處理、洗涂工業(yè)W及食品加工等方面。
[0003] 目前已經(jīng)有許多微生物來源的脂肪酶得到了商業(yè)化生產(chǎn)，并應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各 個(gè)方面。而簇酸醋酶作為一種重要的工業(yè)用酶，在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用的種類和數(shù)量還十 分有限。新型簇酸醋酶資源的挖掘和積累是滿足食品和化工等工業(yè)對簇酸醋酶日益增長需 求的必要條件。本發(fā)明運(yùn)用宏基因組構(gòu)建和簇酸醋酶活性篩選的技術(shù)，獲得深海來源新型 簇酸醋酶，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種新的深海來源簇酸醋酶、其編碼基因及其制備方法，該 簇酸醋酶可用于醋類降解及其他醋類化合物的生物催化和轉(zhuǎn)化。
[0005] 本發(fā)明從太平洋海山深海沉積物宏基因組文庫中，ΚΞ下酸甘油醋作為底物篩選 簇酸醋酶活性，獲得一種新的簇酸醋酶DMWn8-543，其編碼基因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0006] 將該簇酸醋酶序列在GenBank中進(jìn)行同源捜索，與之相似性最高的也是宏基因組 來源的醋酶，相似性為81 % (其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊號為AFB82690)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié) 果表明，簇酸醋酶DMWfl8-543屬于脂類水解酶家族中的第IV家族。根據(jù)氨基酸序列推測，簇 酸醋酶DMWfl8-543的催化中屯、由絲氨酸、谷氨酸和組氨酸(氨基酸位置為144、238和268)組 成，其中絲氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸(氨基酸位置為142至146) 組成的保守序列中，因此簇酸醋酶DMWfl8-543屬于第IV家族GDSAG亞家族。氧離子桐位于75 和76位兩個(gè)甘氨酸。綜上所述，DMWfl8-543應(yīng)為脂類水解酶第IV家族中的一名新成員。
[0007] 在不影響醋酶01胖門8-543蛋白活性前提下，可對569 10^:2所示的遠(yuǎn)離催化中 屯、氨基酸位置(優(yōu)選142-146、238和268氨基酸位置）的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/ 或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有醋酶DMWfl8-543活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)的 公知常識，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是和其功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)的。一般來說，只有發(fā)生在功能 結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)突變可能對蛋白質(zhì)的二維和Ξ維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其生物學(xué)活性。而 對于發(fā)生在遠(yuǎn)離功能結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選遠(yuǎn)離142-146、238和268位氨基酸位置）的氨基酸位點(diǎn)，由 于運(yùn)一區(qū)域不參與蛋白功能構(gòu)象，因而氨基酸的個(gè)別點(diǎn)突變不會對蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn) 生實(shí)質(zhì)性影響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。優(yōu)選的醋酶DMWfl8-543突變體 具有至少與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%W上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%W上 的同源性，最優(yōu)選具有至少99 % W上的同源性。
[000引同理，本發(fā)明還提供了編碼如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基因序列，其與SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列一致;本發(fā)明還提供對SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列中除424-438、712-714和802-804位核巧酸外的其他核巧酸進(jìn)行替換、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)核 巧酸從而獲得編碼能基本保留醋酶DMWfl8-543蛋白生物學(xué)活性的突變體基因。優(yōu)選的醋酶 DMWfl8-543突變體基因具有至少與SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列90%W上的同源性，更 優(yōu)選具有至少95% W上的同源性，最優(yōu)選具有至少99% W上的同源性。
[0009] 利用基因克隆技術(shù)，可將克隆到的醋酶DMWfl8-543基因連接到合適的載體上，并 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物宿主表達(dá)制備重組醋酶DMWfl8-543。合適的原核生物宿 主包括各種細(xì)菌如E.coli等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)等，優(yōu)選采用原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli。
[0010] 合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種可商業(yè)化購買的原核或真核表達(dá)載 體，原核表達(dá)載體如祀T系列載體，P犯系列載體;酵母表達(dá)載體pPICZ-a-A，pHIL-D2，PPIC9， pHlX-Sl(Invitrogen Co巧.San Diego. California.USA);動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pSVK3、pMSG (Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。一個(gè)優(yōu)選的例子是將本發(fā)明篩選到簇酸醋酶 DMWfl8-543的編碼基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a(Novagen)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Rosetta(DE3)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出高活性的重組醋酶。
[0011] 本發(fā)明還提供了簇酸醋酶DMWfl8-543或能表達(dá)簇酸醋酶DMWfl8-543的宿主菌在 工業(yè)上的應(yīng)用，例如可用于催化醋類水解。通過醋酶活力測定表明，簇酸醋酶DMWfl8-543或 上述能表達(dá)簇酸醋酶DMWfl8-543的宿主菌可用于水解短鏈脂肪酸醋，例如C2-C8短碳鏈脂 肪酸醋。優(yōu)選的短鏈脂肪酸醋為具有C2-C8短碳鏈的對硝基苯酪醋，例如對硝基苯酪乙酸 醋、對硝基苯酪下酸醋、對硝基苯酪己酸醋或?qū)ο趸嚼倚了岽椎?，其中底物為對硝基苯?下酸醋(C4)時(shí)催化活性最高，酶活達(dá)444U/mg。
[0012] 簇酸醋酶DMWfl8-543催化水解溫度范圍為15~55°C，優(yōu)選為30~45°C;所述水解 的pH值為5.0~10.0，優(yōu)選為6.0~8.0。在20°C W下保溫2.化，可保持80% W上的殘余酶活； 在30°C和40°C中保溫2.化，可保持50%和37% W上的殘余酶活。本發(fā)明提供的新型簇酸醋 酶及其編碼基因在醫(yī)藥制備、食品加工及風(fēng)味改良、廢水處理、洗涂行業(yè)具有重要的應(yīng)用潛 力。
【附圖說明】
[OOU]圖巧純化簇酸醋酶DMWfl8-543的聚乙酷胺凝膠電泳分析圖。
[0014] 圖2為簇酸醋酶DMWfl8-543的底物特異性圖。C2:對硝基苯酪乙酸醋;C4:對硝基苯 酪下酸醋、C6:對硝基苯酪己酸醋;C8:對硝基苯酪辛酸醋;CIO:對硝基苯酪癸酸醋；定義底 物為C4時(shí)測定值為100 %。
[0015] 圖3為簇酸醋酶DMWf 18-543最適反應(yīng)溫度圖。
[0016] 圖4為簇酸醋酶DMWfl8-543最適反應(yīng)抑圖。
[0017]圖5為二價(jià)陽離子對簇酸醋酶DMWfl8-543棘性影響圖。
[001引圖6為有機(jī)溶劑和去垢劑對簇酸醋酶DMWf 18-543活性影響圖。
[0019] 圖7為簇酸醋酶DMWfl8-543的溫度穩(wěn)定性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1簇酸醋酶DMWf 18-543編碼基因的獲取
[0021] 深海沉積物樣品由深?？梢暥喙苋悠鞑杉蕴窖蠛Ｉ竭吘墶：昊蚪M文庫構(gòu) 建采用CopyControl? HTP fosmid library production kit(Epicentre Biotechnologies，美國），宿主菌株為E. coli EPI30(KEpicentre Biotechnologies，美 國），載體為pCC2F0S fosmid vector化picenhe Biotechnologies,美國）。經(jīng)脈沖場電泳 檢測，插入片段大小為36~48化。取10μ1文庫菌液稀釋至10化1，涂布于簇酸醋酶篩選平板， 30°C培養(yǎng)2天。培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基（lOg/L膜蛋白腺，5g/L酵母抽提物，lOg/L氯化鋼，pH 7.2);滅菌后，無菌條件下加入氯霉素，使其終濃度為12.5yg mri。
[0022] 挑取單克隆并打包，對fosmid打包文庫進(jìn)行測序，拼接后預(yù)測開放閱讀框并注釋 基因，從中篩選脂類水解酶相關(guān)基因。通過Blasts化ttp://blast .ncbi .nlm.n;Lh.gov/)比 對序列與數(shù)據(jù)庫中已知醋酶基因序列的同源性。經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析獲得DMWfl8-543編碼基 因，大小為 909bp，堿基組成為：148A(16.28%)、146T(16.06%)、327C(35.97%WP288G (31.68%)，其核巧酸序列如SEQ ID No: 1所示。編碼蛋白大小為302個(gè)氨基酸殘基，其氨基 酸序列如SEQ ID No:2所示。將該基因序列在GenBank中進(jìn)行同源捜索，與之相似性最高的 簇酸醋酶也為宏基因組，相似性為81 %，其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊號為AFB82690。
[0023] 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，簇酸醋酶DMWfl8-543屬于脂類水解酶家族中的第IV家 族。根據(jù)氨基酸序列推測，簇酸醋酶DMWfl8-543的催化中屯、由絲氨酸、谷氨酸和組氨酸(氨 基酸位置為144、238和268)組成，其中絲氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨 酸(氨基酸位置為142至146)組成的保守區(qū)域中，因此簇酸醋酶mwn8-543屬于第IV家族 GDSAG亞家族。而氧離子桐位于75和76位兩個(gè)甘氨酸。
[0024] 綜上所述，DMWf 18-543應(yīng)為脂類水解酶第IV家族中的一名新成員。
[00巧]實(shí)施例2簇酸醋酶DMWf 18-543的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建
[0026] 將本發(fā)明獲得的簇酸醋酶DMWf