一種巰基蛋白酶的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種琉基蛋白酶的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木馨淀粉磁性微球是W磁性Fe3〇4及天然高分子物質(zhì)木馨淀粉為原材料的一種可 生物降解功能材料。目前，國內(nèi)外研究大多采用合成高分子材料為殼制備高分子磁性微球， 而W天然高分子物質(zhì)木馨淀粉為原材料，相對于合成高分子材料具有可降解性、無毒性、生 物相容性、環(huán)境友好且來源豐富等特點。高分子磁性微球既具有高分子的特性，可通過交 聯(lián)、共聚、接枝、表面改性等賦予其多種性能。高分子磁性微球又因具有磁響應(yīng)性，在外加磁 場作用下可迅速分離，且操作簡便，至今，在生物分離如細胞分離、標記、核酸排序等，生物 醫(yī)學(xué)如祀向給藥、臨床診斷，和生物工程如作為載體酶的固定化等方面得到快速的發(fā)展。近 年來，磁性高分子微球的特殊性能和其顯示的廣闊應(yīng)用前景受到人們的廣泛關(guān)注，使得高 分子磁性微球在多個領(lǐng)域顯示出強大的生命力，已滲透到分離工程等許多領(lǐng)域。
[0003] 琉基蛋白酶是指一類活性中屯、含有琉基(半脫氨酸），并且依靠琉基催化水解膚鍵 的蛋白水解酶，包括溶菌酶、渡蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶等。W木瓜蛋白酶為例，其可水解多 膚中賴氨酸、精氨酸和蛋白質(zhì)的簇基端，是一種可食用的活性半脫氨酸蛋白酶。它具有天 然、衛(wèi)生安全、酶活高且熱穩(wěn)定性好等特點，不僅在廣泛應(yīng)用于食品、飼料、日化等方面，在 醫(yī)藥、皮革及紡織等行業(yè)也有了一定的應(yīng)用，目前主要應(yīng)用于肉的嫩化和啤酒的澄清等。木 瓜蛋白酶主要存在于番木瓜的根、莖、葉和果實中，其含量在未成熟的乳汁中最豐富。由于 木瓜蛋白酶為天然產(chǎn)物，如何從植物中更快更好的分離成為科研工作者們的研究熱點。
[0004] 目前提取木瓜蛋白酶的技術(shù)多樣，主要包括親和層析法、超濾法、有機溶劑法、鹽 析法、絮凝法和噴霧干燥法等。親和層析法分離得到的酶純度高，但前處理液需進行初步純 化，且層析法操作過程繁瑣，不易進行工業(yè)化生產(chǎn);超濾法因木瓜蛋白酶為大分子物質(zhì)，在 超濾過程中易聚積在膜表面，產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象，導(dǎo)致超濾速率下降；有機溶劑法程序復(fù) 雜，過程采用了大量的機物質(zhì)，易產(chǎn)生有機溶劑殘留和木瓜蛋白酶易變性等問題;鹽析法使 用大量的鹽，產(chǎn)生較大灰分，易使酶變性，得到產(chǎn)品的活性較低;絮凝法由于其專一性不強， 分離得到的木瓜蛋白酶含較多雜質(zhì)，純度不高;噴霧干燥法易發(fā)生木瓜蛋白酶粘結(jié)在容器 壁導(dǎo)致活性降低等問題。
[0005] 文獻《功能納米顆粒對木瓜蛋白酶吸附動力學(xué)及熱力學(xué)研究》報道利用殼聚糖磁 性微球吸附分離木瓜蛋白酶，但是其對木瓜蛋白酶的平衡吸附量較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中琉基蛋白酶分離過程復(fù)雜，步 驟繁多，而提供了一種琉基蛋白酶的提取方法。本發(fā)明的分離方法操作簡單，時間短，設(shè)備 要求簡單，且平衡吸附量較高。
[0007] 發(fā)明人經(jīng)過試驗創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)將木馨淀粉磁性微球應(yīng)用于琉基蛋白酶的吸附分 離，運用磁性分離技術(shù)，在短時間內(nèi)實現(xiàn)快速分離，可將許多煩瑣復(fù)雜的操作簡單化，使傳 統(tǒng)測試的周期大大縮短。
[0008] 本發(fā)明提供了一種琉基蛋白酶的提取方法，其包括W下步驟：（1)將木馨淀粉磁性 微球，與含有琉基蛋白酶的溶液混合后進行振蕩吸附；（2)將步驟（1)的反應(yīng)液進行磁性分 離后，將木馨淀粉磁性微球進行洗脫，即可。
[0009] 本發(fā)明所述的琉基蛋白酶是指本領(lǐng)域中的一類活性中屯、含有琉基(半脫氨酸），并 且依靠琉基催化水解膚鍵的蛋白水解酶，一般包括溶菌酶、渡蘿蛋白酶或木瓜蛋白酶等。
[0010] 步驟(1)中，所述的振蕩吸附的方法優(yōu)選靜態(tài)吸附法。所述的振蕩吸附優(yōu)選采用恒 溫搖床進行振蕩吸附。所述的振蕩吸附的轉(zhuǎn)速可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選 100~2(K)r/min，更優(yōu)選15化/min。所述的振蕩吸附的溫度可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇， 優(yōu)選20~45°C，更優(yōu)選25~40°C;進一步優(yōu)選30~35°C。所述的振蕩吸附的時間可為使所述 的振蕩吸附的吸附量趨于平衡，即可;例如當(dāng)所述的木馨淀粉磁性微球的用量為〇.2g，琉基 蛋白酶為木瓜蛋白酶，且所述的含木瓜蛋白酶的溶液為20mL，所述的木瓜蛋白酶濃度為 Img/mL時，所述的振蕩吸附的時間優(yōu)選10~300min，例如：20min、30min、40min、50min、 60min、70min、80min、90min、100min、120min、150min、180min 或 240min，更優(yōu)選 60min;又如， 當(dāng)所述的木馨淀粉磁性微球的用量為1.2g，琉基蛋白酶為溶菌酶，且所述的含溶菌酶的溶 液為20mL，所述的溶菌酶濃度為0.5mg/mL時，所述的振蕩吸附的時間優(yōu)選10~300min，例 女日：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、lOOmin、120min、ISOmin、 ISOmin 或 240min，更優(yōu)選 ISOmin。
[0011] 步驟（1)中，所述的木馨淀粉磁性微球的用量可為本領(lǐng)域常規(guī)的可將所述的琉基 蛋白酶吸附，即可;本發(fā)明中所述的木馨淀粉磁性微球與所述的琉基蛋白酶的質(zhì)量比優(yōu)選 2.5:1~12.5:1，更優(yōu)選5:1~12:1，進一步優(yōu)選7.5:1~10:1。
[0012] 步驟（1)中，所述的含有琉基蛋白酶溶液優(yōu)選為將琉基蛋白酶溶于化is-HCl緩沖 液中得到的含有琉基蛋白酶溶液;所述的含有琉基蛋白酶溶液的pH值優(yōu)選5~10,更優(yōu)選6 ~9,進一步優(yōu)選7~8.5,更進一步優(yōu)選7~8;所述的含有琉基蛋白酶溶液中琉基蛋白酶的 濃度優(yōu)選0.5~Img/mL。
[0013] 步驟(2)中，所述的洗脫的洗脫液可W為本領(lǐng)域常規(guī)的可將琉基蛋白酶從木馨磁 性微球上洗脫下來的洗脫液，本發(fā)明優(yōu)選為：pH為4.5~6.5(更優(yōu)選pH為5)，且含0.9~ 1. Imol/L(優(yōu)選1.0mol/L)NaCl的醋酸和醋酸鹽緩沖液;所述的醋酸鹽優(yōu)選醋酸鋼。
[0014] 木馨淀粉磁性微球吸附含琉基蛋白酶的吸附原理可為:淀粉上裸露的活潑徑基的 親水性，和淀粉對蛋白酶的親和性，木馨淀粉中含有0.07 % -0.09 %的憐，對酶具有親和作 用；淀粉磁性微球中的四氧化Ξ鐵磁性粒子中的鐵帶正電荷，能夠與酶中琉基中孤對電子 產(chǎn)生靜電作用吸附，從而實現(xiàn)了蛋白酶的吸附分離。
[0015] 在不違背本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳 實例。
[0016] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0017] 本發(fā)明的積極進步效果在于：（1)采用磁性分離技術(shù)，實現(xiàn)固液快速分離。木馨淀 粉磁性微球可作為親和吸附材料，通過靜電作用或配位作用與木瓜蛋白酶結(jié)合，對木瓜蛋 白酶的吸附率可W達到23.98~47.22%，采用磁性吸附進行快速分離。洗脫得到解吸率為 88.56~91.48%，測得相對酶活為60.21 %~69.7%。（2)利用木馨淀粉磁性微球吸附分離 溶菌酶額的吸附量可為5.87mg/g，吸附率可為73.42%; (3)木馨淀粉磁性微球為環(huán)保型吸 附劑，具有無毒、無污染，對環(huán)境友好。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0019] 本發(fā)明【具體實施方式】部分設(shè)及的木馨淀粉磁性微球均參照文獻木馨淀粉磁性微 球的制備及表征，食品科技，2014，39(6)，242-246制備得到。
[0020] 實施例1
[0021] 步驟(1)W木馨淀粉磁性微球為吸附劑，木瓜蛋白酶為模型蛋白，采用靜態(tài)吸附法 進行吸