的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034]實施例中所用馬來酸順反異構(gòu)酶，購于江南大學(xué)，由來源于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的馬來酸順反異構(gòu)酶編碼基因重組大腸桿菌BL21表達產(chǎn)生;購買廠家只是說明原料的可行性，不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0035]實施例1馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力的測定
[0036]取450μ1用pH8.4反應(yīng)緩沖溶液(50mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液)適當(dāng)稀釋的酶液(酶液比活為50U/mg)，加入50μ1、lmol/L馬來酸(Κ0Η調(diào)至pH8.4)溶液，于37°C反應(yīng)20min后，用0.45μπι有機濾膜過濾，濾液用HPLC測定富馬酸含量。酶活的定義:37°C、pH 8.4的條件下該反應(yīng)體系中每分鐘轉(zhuǎn)化底物馬來酸生成Iymol產(chǎn)物富馬酸所需的酶量定義為一個酶活力單位1U。
[0037]HPLC色譜柱為LaChrom C18(5ym 4.6X250mm);流動相為體積分數(shù)8%的甲醇水溶液，流速0.6mL/min ； UV檢測器測波長為21 Onm，柱溫為30°C。
[0038]實施例2巖藻糖濃度對馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力的影響
[0039]在實施例1中的反應(yīng)體系中添加巖藻糖，巖藻糖終濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、
0.7、1.0mmol/L。實驗結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，當(dāng)為巖藻糖濃度為0.5mmol/L時，酶活力最尚，比未添加巖操糖的提尚了26%。
[0040]相對酶活力的定義:以反應(yīng)體系中不添加巖藻糖時測得的酶活為分母，得到不同巖藻糖濃度下測定的相對酶活。
[0041 ]實施例3巖藻糖對馬來酸順反異構(gòu)酶反應(yīng)穩(wěn)定性的影響
[0042]對照組的酶液不添加巖藻糖，試驗組的酶液添加0.5mmol/L的巖藻糖，室溫放存，每Sh取酶液按實施例1中的方法檢測酶活力，實驗結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，添加巖藻糖組酶活力的衰減速率較慢，48h后酶活保留率為84.2%，而此時未加巖藻糖組的酶活保留率僅為58%
[0043]相對酶活力的定義:以反應(yīng)體系中未添加巖藻糖組Oh測得的酶活為分母，得到不同時間點測定的相對酶活。
[0044]酶活保留率:(室溫放存Oh的酶活-取樣時的酶活)/室溫放存Oh的酶活。
[0045]實施例4利用巖藻糖提高馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力的方法
[0046]取450μ1用pH8.4反應(yīng)緩沖溶液(50mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液)適當(dāng)稀釋的酶液(酶液比活為50U/mg)，加入50μ1、lmol/L馬來酸(Κ0Η調(diào)至pH8.4)溶液，反應(yīng)體系中添加1μ
1、0.25mol/L的巖藻糖水溶液(反應(yīng)體系中巖藻糖終濃度為0.5mmol/L)，于37°C反應(yīng)20min。
[0047]實施例5?7利用巖藻糖提高馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力的方法
[0048]實施例5?7與實施例4的區(qū)別在于:反應(yīng)體系中添加的巖藻糖濃度分別為:0.3、0.7和1.0mmol/L。
[0049]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1.巖藻糖在提高馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力中的應(yīng)用。2.—種利用巖藻糖提高馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力的方法，其特征在于，在馬來酸順反異構(gòu)酶參與的酶解反應(yīng)體系中添加巖藻糖。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述巖藻糖相對于酶解反應(yīng)體系的添加濃度為0.3?I.0mmol/L，優(yōu)選0..Smmol /L4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶解反應(yīng)體系中，馬來酸順反異構(gòu)酶的濃度為20?200U，反應(yīng)底物的濃度為100?2500mmol/L;優(yōu)選馬來酸順反異構(gòu)酶的濃度為25?50U，反應(yīng)底物的濃度為100?1000mmol/L。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)底物為馬來酸或馬來酸鹽。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述巖藻糖為固體或水溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶解反應(yīng)條件為20?50°C，pH3.5?9.0;優(yōu)選 37°C，pH8.4。8.根據(jù)權(quán)利要求5?7任一項所述的方法，其特征在于，所述馬來酸順反異構(gòu)酶來源于假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)或含有馬來酸順反異構(gòu)酶基因或其突變體基因的工程菌的培養(yǎng)物或分泌物。9.一種以馬來酸為原料生產(chǎn)富馬酸的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將比活為50U/mg的馬來酸順反異構(gòu)酶酶液，用緩沖液稀釋至pH8.4，加入pH8.4濃度為lmol/L的馬來酸溶液中； 所述馬來酸順反異構(gòu)酶酶液與馬來酸溶液的體積比為9:1 ； 2)加入巖藻糖，使巖藻糖相對于整個反應(yīng)體系的濃度為0.3?1.0mmo 1/L; 3)35?40°C反應(yīng)15?30min，用0.45μηι有機濾膜過濾，收集濾液進行處理，得到富馬酸。10.根據(jù)權(quán)利要求2?8任一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為pH8.4，50mmol/L的 NaHP04-KH2P04 緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明涉及酶化學(xué)領(lǐng)域，具體公開一種利用巖藻糖提高馬來酸順反異構(gòu)酶酶活力的方法，具體為在馬來酸順反異構(gòu)酶參與的酶解反應(yīng)體系中添加巖藻糖。本發(fā)明通過實驗優(yōu)化了巖藻糖的添加濃度，使最大程度的提高馬來酸順反異構(gòu)酶的酶活力。本發(fā)明所述方法簡單易行，在馬來酸順反異構(gòu)酶反應(yīng)過程中具有可以節(jié)約酶用量，提高反應(yīng)效率的優(yōu)點。
【IPC分類】C12P7/46, C12N9/90
【公開號】CN105505909
【申請?zhí)枴緾N201511033116
【發(fā)明人】秦晴, 許 鵬, 馮杰, 楊為華, 紀傳俠, 婁雯
【申請人】安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月31日