一種鑒別苦蘵的核苷酸序列、特異性引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別苦藤的技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種鑒別苦藤的核巧 酸序列、特異性引物及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 苦藤（Physalis angular L.)，為茄科（Solanaceae)酸漿屬（Physalis) -年生草 本植物，分布于世界熱帶與亞熱帶地區(qū)，常生于海拔500~1500米。在我國主要分布于華東、 華中、華南及西南等地。作為傳統(tǒng)藥材，幾個世紀(jì)W來，苦藤W果、根或全草入藥，可用于多 種疾病的治療，早在秦漢時期的《爾雅》中就有記載，很多中藥材地方志中均有對其描述。其 性味苦、寒，主治咽喉腫痛、腮腺炎、急慢性氣管炎、肺脈瘍、頻疾、小便不利和外用治脈泡瘡 等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明苦藤主要有醉茄內(nèi)醋、酸漿苦素、黃酬、生物堿及醬醇等化學(xué)成分，其 中酸漿苦素和谷醬醇具有多種體內(nèi)外的抗癌活性，對于宮頸癌和皮膚癌都具有明顯療效。 另外，苦藤果實(shí)中的多糖對超氧陰離子自由基和二苯代苦味自由基起抗氧化作用，苦藤提 取液具有抗菌消炎、降血糖、降血脂等療效。
[0003] 苦藤與小酸漿P.minima、酸漿P.alkekengi及毛酸漿P.pubescens等其他酸漿屬植 物的形態(tài)學(xué)特征非常相似(包括莖、葉、花及果實(shí)等特征），因此，利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法 很難將苦藤與其他酸漿屬相似植物快速準(zhǔn)確的鑒別開。所W，在過去，將其他酸漿屬植物誤 認(rèn)為苦藤進(jìn)行使用的情況經(jīng)常發(fā)生，運(yùn)為苦藤藥材資源的安全使用和保護(hù)帶來了困難。
[0004] 隨著生物科學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)彌補(bǔ)和克服了傳統(tǒng)鑒別方法的一些缺陷 和難題，已經(jīng)成為了植物輔助鑒別的重要手段。本申請人運(yùn)用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)（stad codon targeted Polymor地ism,SCoT)分子標(biāo)記方法，對苦藤及其他一些酸漿屬植物進(jìn)行 DNA指紋圖譜研究，從中篩選出苦藤特異性DNA片段，通過TA克隆、測序等方法，設(shè)計(jì)發(fā)明了 特異性引物，應(yīng)用于苦藤的鑒定，為有效的鑒別和保護(hù)苦藤藥材資源提供有效的分子技術(shù) 依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒別苦藤的核巧酸序 列。
[0006] 本發(fā)明用于鑒別苦藤的特征性核巧酸序列來源于SCoT通用引物3(5'-CAACAATGGCTACCACCG-3 '）擴(kuò)增所得的苦藤特異性DNA片段，具體序列為：
[0007]

CGGTGGTAGCCATTGTTG，如沈Q ID NO.l所示；
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供基于上述鑒別苦藤的核巧酸序列設(shè)計(jì)的用于鑒別苦 藤的特異性引物(ST3KZF/ST3KZR)，該特異性引物序列如下：
[0009] 上游引物ST3KZF: 5' -GCACCTCGCAATACCGCACA-3'，如沈Q ID NO. 2所示；
[0010] 下游引物ST3KZR: 5 ' -TCCCCAACTCGAATCAACCG-3 '，如沈Q ID NO. 3所示。
[0011] 上述特異性引物（ST3KZF/ST3KZR)，具有極高的專一性，僅與苦藤發(fā)生反應(yīng)，而不 與其他酸漿屬植物樣品反應(yīng)。利用該特異性引物通過常規(guī)PCR擴(kuò)增可W快速的對苦藤進(jìn)行 鑒別。
[0012]本發(fā)明的第Ξ個目的是提供利用上述特異性引物(ST3KZF/ST3KZR)進(jìn)行鑒另睹藤 的方法。
[001引本發(fā)明采用上述引物組合（ST3KZF/ST3KZR)作為特異性擴(kuò)增引物，W苦藤基因組 DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測，獲得清晰的苦藤特異性條帶，實(shí)現(xiàn)對苦藤的快速鑒別。
[0014] 本發(fā)明具有的有益效果：
[0015] (1)樣品用量少，只需少量樣品材料就可W完成整個操作；
[0016] (2)準(zhǔn)確、靈敏性高，ST3KZF/ST3KZR為苦藤專一性擴(kuò)增引物，若為其他酸漿屬植物 種類，為陰性反應(yīng)；
[0017] (3)方法簡便，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，時間短，3-5小時即可完成。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明所述的苦藤的特異性核巧酸序列及對苦藤特異性引物ST3KZF和 ST3KZR的位置圖，左側(cè)為5 '端，右側(cè)為3 '端，其中黑色部分為特異性引物ST3KZF和ST3KZR擴(kuò) 增的序列片段大小及位置；
[0019] 圖2是采用SCOT引物3按照常規(guī)PCR方法對酸漿屬植物進(jìn)行PCR反應(yīng)后的電泳圖（箭 頭所指的條帶是苦藤特有的條帶，分子量為1404bp)，其中通道1~4:小酸漿P.minima;5~ 13:苦藤P.angula1:a; 14~17:酸漿P.a化ekengi ; 18~20:毛酸漿P.pubescens ;M為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000;
[0020] 圖3是利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物ST3KZF/ST3KS?對酸漿屬植物樣品進(jìn)行檢測 的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中通道1~4:小酸漿P.minima;5~13:苦藤P.angulata;14~17:酸漿 P. a化ekengi ; 18~20:毛酸漿P. pubescens ;M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000;
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明可W從分子水平上較為客觀準(zhǔn)確的鑒別苦藤，通過W下實(shí)施例對本發(fā)明做 進(jìn)一步說明：
[0022] 實(shí)施例1:苦藤特征性核巧酸序列的制備
[0023] 1.基因組DNA的提取
[0024] 剪取酸漿屬植物樣品（見表1)新鮮葉片lOOmg放入研鉢中，立即加入液氮研磨至粉 末，然后使用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取基 因組DNA，用0.8 %瓊脂糖膠對所得DNA進(jìn)行電泳檢測，并用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，稀 釋至 50ng/yl。
[0025] 表1.發(fā)明實(shí)驗(yàn)中所用的酸漿屬植物樣品
[0026]
[0027]
[002引 2.SC0T-PCR反應(yīng)，電泳檢測
[0029] 利用SCoT通用引物3(5'-CAACAATGGCTACCACCG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工 生物工程有限公司合成，反應(yīng)體系（總體積20μ1)為：10 X Buff er化1，MgCl2(25mM) 2μ1， dNTPs (lOmM) 0.祉1，SCoT 引物3 (ΙΟμΜ) 1μ1，0.5μ1 Taq 酶（2υ/μ1)，化1 模板 DNA( 50ng/yl)， 12.7μ1 dd出 0。
[0030] PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min; 35個循環(huán)(94°C變性50s，51°C退火50s，72°C延 伸1.5min);最后于72°C下延伸lOmin。
[0031] PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2,箭頭標(biāo)的條帶（分子量為1404bp，通道5~13)，是采用 SCOT引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增時篩選出的苦藤特征性條帶。如圖2(圖中，通道1~20為來自4種不 同酸漿屬植物的樣品，編號如表1，具體見【附圖說明】；通道Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000)所示，僅苦藤(通道5~13)在分子量1404bp位置有條帶出現(xiàn)，而其他酸漿屬植物在 分子量1404bp位置沒有條帶出現(xiàn)。因此，此條帶為苦藤的特有條帶。