AaALDH1基因啟動子及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，設及一種啟動子及其應用，尤其設及一種在植物分泌 型腺毛中特異表達的轉(zhuǎn)運蛋白基因啟動子(proAaAL的Π )及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛屬的一年生草本植物，從青葛中可W提取一 種倍半祗內(nèi)醋類過氧化物一一青葛素，青葛素對治療追疾效果顯著，被世界衛(wèi)生組織稱做 是"世界上唯一有效的追疾治療藥物"。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療追疾的方 法就是青葛素聯(lián)合療法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)。植物青葛是 目前世界上唯一獲取青葛素的天然資源，但其青葛素合成量極低，僅為干重的0.1-0.8%， 使得運種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。
[0003] 在目前的青葛基因工程研究中，多采用組成型的啟動子，例如煙草花葉病毒35S啟 動子(CaMV35)。運種啟動子能夠驅(qū)動外源基因在所有的組織和器官中表達，可能會對植物 的正常生長造成一定的負擔和危害。由于腺毛特異表達的啟動子對于植物的腺毛系統(tǒng)進行 遺傳操作，不會對植物的生長發(fā)育造成危害，可W克服組成型啟動子的種種弊端，因此，克 隆得到青葛分泌型腺毛特異性的啟動子對青葛素代謝工程具有較為重要的意義。
[0004] AaALDHI (青葛醒還原酶基因）編碼青葛素合成途徑下游的一個關(guān)鍵酶，可W催化 青葛素前體青葛醒和二氨青葛醒的氧化反應。AaALDHI在葉片發(fā)育初期及不同組織部位中 的表達譜與青葛素合成途徑中分泌型腺毛特異性表達的基因 ADS、CYP71AV1和DBR2均具有 較高的相似性。因此，該基因的啟動子也極有可能在分泌型腺毛中特異性表達。
[000引因此，本發(fā)明致力于開發(fā)一種植物腺毛組織特異表達的啟動子，尤其是一種 AaALDHI啟動子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種使基因在植 物分泌型腺毛中特異性表達的啟動子，尤其是使AaALDHI基因在植物分泌型腺毛中特異高 效表達的啟動子，從而為研究AaALDHI基因的表達調(diào)控和分析啟動子上的順式作用元件奠 定基礎，也對利用植物腺毛組織表達和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種具有重要意義。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種啟動子，該啟動子是能調(diào)控基因在 分泌型腺毛中特異表達，其核巧酸序列如SEQ ID No: 1所示。該啟動子為特異型啟動子。
[0008] 進一步地，該啟動子是青葛AaAL的Π 基因上游的啟動子。
[0009] 進一步地，該啟動子上的順式作用元件包括：TATA box、CAAT box、GARE-motif、 AE-b ο X、GA-mo t i f、ARE、H沈和 TCCC-motif。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供上述啟動子的應用，是在利用植物分泌型腺毛組織表達和 生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中的應用。
[0011] 進一步地，其中代謝產(chǎn)物為青葛素。
[0012] 本發(fā)明的又一方面提供一種載體，該載體連接有如上所述的啟動子。該載體可W 是 pCAMBIA1391z 載體。
[0013] 本發(fā)明的再一方面，提供一種制備高產(chǎn)青葛素的轉(zhuǎn)基因青葛的方法，包括W下步 驟：
[0014] 步驟一、根據(jù)青葛基因組中AaALDHl基因啟動子序列，利用巢式PCR克隆如上所述 的啟動子的序列；
[0015] 步驟二、將步驟一中獲得的AaALD化基因的啟動子的序列連入PCAMBIA1391Z載體， 獲得 pCAMB IA1391 Z-proAaALDHl 載體；
[0016 ] 步驟立、將步驟二中獲得的pCAMBIAl 391 Z-proAaAL畑1載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；
[0017] 步驟四、將步驟Ξ中獲得的帶有pCAMBIA1391Z-proAaAL的Π 載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn) 化青葛，并進行檢測；
[0018] 步驟五、確定所述啟動子所引導的GUS報告基因在植株中的表達部位。
[0019] 優(yōu)選地，其中啟動子與青葛素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因融合，從而加強青葛合成 途徑，最終提高青葛素的合成。該青葛素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因可W是AaALD化基因等。
[0020] 優(yōu)選地，其中巢式PCR的引物序列為：
[0021 ]第一輪PCR:proALDHl-FPl: 5 '-TGGCTTGCTGTTCAAAGAAGGCTAA-3 ' ；
[0022] proALDHl-RPl: 5 '-GCCTTMCGGCCAAATCAATGTCTT-3 ' ；
[0023] 第二輪口(：1':口'〇40)化斗口2:5'-17666(：了41'170：1'1'(：174666(：1^6(：-3'；
[0024] proALDHl-RP2:5 '-GTTGCTAACACTTCTTCTGTCGCTGGAT-3 '；
[00巧]優(yōu)選地，為構(gòu)建pCAMBIA1391z-proAaALDHl載體，在proAaALDHl兩端分別引入了 HindllI的酶切位點和Bam HI的酶切位點，使用的引物序為：
[0026] 1391Z-proAaALDHl-FP:5 '-CCCAAGCTTATGAACCATTAGAAG-3 '
[0027] 1391Z-proAaALDHl-RP:5'-CGCGGATCCCTTTGTTTTTTATGA-3'。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種表達盒，該表達盒包括如前所述的啟動子。優(yōu)選地，該表達盒 為proAaALDHl-GUS表達盒，在該表達盒中，可W插入青葛素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，也可 W插入想要在分泌型腺毛中表達的基因。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用有效的青葛表皮毛組織特異 性啟動子代替組成型啟動子，可W通過分子生物學的方法構(gòu)建在青葛分泌型腺毛特異表達 目的基因的融合基因，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)入其他植物的基因組中，從而實現(xiàn)目的基 因的定向操作W獲得轉(zhuǎn)基因植物，并且不會對植物的生長發(fā)育造成危害，能廣泛用于利用 植物腺毛組織表達和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中。另外，克隆proAaALDHl啟動子將為 研究AaALD化基因的表達調(diào)控和分析啟動子上的順式作用元件奠定基礎。
[0030] W下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體步驟及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進一步說明，W 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0031] 圖1是本發(fā)明的一個較佳實施例的轉(zhuǎn)基因青葛植株的PCR檢測結(jié)果圖。其中，M:分 子量標記；泳道1:陽性對照；泳道2:陰性對照；泳道3和4、5和6、7和8、9和10 W及11和12:分 別是5株轉(zhuǎn)基因青葛植株基因組為模版，進行的兩次單獨的PCR得到的產(chǎn)物。
[0032] 圖2是本發(fā)明的一個較佳實施例利用AaALDHl基因啟動子與GUS基因融合的載體 pCAMBIA1391z-proAaALD化轉(zhuǎn)化青葛后，所獲得的轉(zhuǎn)基因青葛中的GUS組織染色圖。
【具體實施方式】
[0033] 下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人的《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?化wYork:ColdSp;ring化;rbo;rLaborato;ryPress，1989年 版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0034] 本實施例設及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細良，田云龍，郭萍，朱昌雄； 根癌農(nóng)桿菌介導的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國生物工程雜志，2008，28(3): 38-43》文 獻中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105和質(zhì)粒PCAMBIA1391Z可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如可 W從澳大利亞GAMBIA公司購得，菌株編號為Gambarl。
[003引實施例1 AaALD化基因啟動子的獲得
[0036] 1、培養(yǎng)青葛無菌苗
[0037] 青葛種子用體積分數(shù)為75%的乙醇浸泡Imin，再用20%(w/v)的化αο浸泡20min 后，無菌水沖洗3次-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養(yǎng)基上，25 °C、1化/她（日光/黑夜)光照培養(yǎng)，14天后即可獲得青葛無菌苗。
[003引 2、基因組DNA的提取
[0039] 在1.5血離屯、管中放一片青葛葉片（1cm2左右大小，用冰盒盛?。尤?粒鋼珠。加 入300μΙ TPS buffer(通風楓內(nèi)操作，TPS中含有琉基乙醇），55-60Hz，震蕩90s。再加入300μ L TPS buffer(通風楓）d65°C水浴化(每隔20min搖一搖），可適當延長時間，最長1.化。冷卻 至室溫，4°C 1000化pm離屯、15min。取30化心40化L上清液。加入30化心40化L異丙醇（異丙醇 在-20°C預冷）?；旌虾笤?20°C冰箱中放置10-15min(可延長至化）。取出4°C離屯、12000rpm， 吸去上清，在通風楓中倒置l〇-15min。加入75%乙醇500-60化L，將沉淀吹打起或用手指彈 起，放在搖床上搖15-20min，重復一次。吸干液體，放在37°C中烘干，直到沉淀變?yōu)橥该?。?入50yLdd出0回溶，即獲得基因組DNA，4°C保存。
[0040] 3、PCR 擴增
[00川 W上述獲得的基因組DM為模板，利用PCR方法擴增AaALDHl基因啟動子 proAaALDHl序列。為了提高產(chǎn)物的特異性，采用兩輪巢式PCR擴增，根據(jù)基因組測序得到的 AaALDHl基因的啟動子序列設計巢式PCR引物如表1所示，第一輪PCR反應體系如表2所示。 PCR條件為:95°C預變性5min;