與漆溝藻毒素1和4特異性結(jié)合的高親和力適配體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一條基于氧化石墨締 SELEX技術(shù)篩選獲得的 與漆溝藻毒素1和4特異性結(jié)合的高親和力適配體,為樣品中痕量漆溝藻毒素1和4的分離富 集,漆溝藻毒素1和4的快速檢測,中和或括抗漆溝藻毒素1和4藥物的制備,W及水體中毒素 的去除奠定了基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] 麻搏性貝類中毒是Ξ大世界性海洋生物公害之一。漆溝藻毒素1和4 (Gonyautoxinl and Gonyautoxin 4,GTX1 and GTX4)及其類似物漆溝藻毒素2和3(GTX2 and GTX3)、石房始毒素(Saxitoxin,STX)和新石房始毒素(neoSTX)是麻搏性貝類毒素中最 具代表性的神經(jīng)毒素。GTX1和GTX4可通過水中食物鏈在魚類和貝類體內(nèi)蓄積,人類誤食運 些染毒的水產(chǎn)品后就會引起麻搏性貝類中毒。中毒的癥狀主要包括四肢肌肉麻搏、頭痛惡 屯、、流誕發(fā)燒、皮疹等。中毒嚴(yán)重時,則會出現(xiàn)呼吸困難,咽喉緊張;隨著肌肉麻搏不斷擴展 加重,最終導(dǎo)致死亡。麻搏性貝類毒素的毒性很強,攝入Img就可致人死亡,對動物神經(jīng)系統(tǒng) 和屯、血管系統(tǒng)有高度特異性,使人中毒的范圍在600-5000MU之間(Mu為毒力單位,IMu是指 使18-22g的小白鼠在15min內(nèi)死亡的毒力),致死劑量為3000-30 OOOMu。世界各地都有包括 GTX1和GTX4在內(nèi)的麻搏性貝類毒素的分布,尤其是歐洲及北美一些國家。我國東南沿海一 帶地區(qū)也經(jīng)常發(fā)生食用有毒始類、螺類、貝類引發(fā)的人中毒事件。由于染有GTX1和GTX4的貝 類嚴(yán)重地危害著人類的健康和全球貝類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,因此對于海洋生物毒素 GTX巧日GTX4的 檢測顯得尤為重要。長期W來,一直用于GTX1和GTX4檢測的方法是國際上公認(rèn)的小鼠生物 學(xué)法。然而,運種方法的靈敏度低,成本高,W及需要使用大量的動物等。也有一些其他的分 析方法的建立例如高效液相色譜法化PLC),質(zhì)譜(MS),巧光(fluorescence)及各種技術(shù)聯(lián) 用等,特別是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)被歐盟確定為首要的檢測方法。但是,運些方法需要昂貴的 儀器設(shè)備、專業(yè)的技術(shù)人員、檢測耗時長W及毒素的標(biāo)準(zhǔn)品難W獲得等問題。因此,仍迫切 需要研發(fā)一種靈敏、穩(wěn)定和廉價的檢測系統(tǒng)用于海洋生物毒素 GTX1和GTX4的現(xiàn)場快速偵 測。對于一種現(xiàn)場快速檢測方法而言,最關(guān)鍵的部分是分子識別探針,如常用的抗體和受體 等。
[0003] 核酸適配體是一種具有功能的單鏈DNA或DNA,是通過體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富 集性配體系統(tǒng)進化,Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)從 隨機核酸文庫中獲得的寡核巧酸序列。運些適配體序列通過分子間的作用力,例如氨鍵,范 德華力,芳香環(huán)堆積作用力等折疊成穩(wěn)定的獨特的Ξ維空間,而與祀分子高親和力,強特異 性的結(jié)合。相對于抗體而言,適配體存在許多優(yōu)勢,包括其穩(wěn)定性高,免疫原性低,組織滲透 性強,一致性好,不需要免疫動物等,故適配體作為一種新型的分析識別元件在檢測,診斷 和治療方面都很有前景。近年來已有學(xué)者將適配體應(yīng)用于海洋生物毒素檢測領(lǐng)域,與生物 傳感器平臺結(jié)合,研發(fā)了許多快速、新穎的檢測方法而備受關(guān)注。
[0004] 然而,關(guān)于與GTX1和GTX4特異性結(jié)合的分子識別探針,與GTX1和GTX4特異性結(jié)合 的高親和力適配體,w及該適配體的親和常數(shù)鑒定、優(yōu)化及應(yīng)用尚無相關(guān)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一條與漆溝藻毒素1和4特異性結(jié)合的高親和力適配體。本 發(fā)明的第二目的在于提供通過截短的方法對該適配體進行優(yōu)化得到一條特異性結(jié)合GTX1 和GTX4親和力更高的適配體(G018-T-d)。本發(fā)明的再一目的是提供上述適配體在制備樣品 中痕量漆溝藻毒素1和4的分離富集試劑中、在制備漆溝藻毒素1和4檢測試劑或試劑盒中、 在制備預(yù)防或治療漆溝藻毒素1和4中毒藥物中,W及在制備去除水體中漆溝藻毒素1和4制 劑中等多方面的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是:基于氧化石墨締 SELEX技術(shù)篩選得到一條與漆溝藻毒 素1和4特異性結(jié)合的高親和力適配體。該單鏈DNA適配體可用于樣品中痕量GTX1和GTX4的 分離富集,GTX巧日GTX4的分析檢測,中和或括抗漆溝藻毒素巧日4藥物的制備,W及水體中毒 素的去除。
[0007] 本發(fā)明的第一方面,是提供了一條與漆溝藻毒素1和4(GTX1和GTX4)特異性結(jié)合的 高親和力適配體,具有如下所示的通式:
[000引 5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3';其中,N代表堿基A,T, C,G中任一個,N40代表長度為40bp的隨機序列。
[0009] 優(yōu)選的,所述單鏈DNA適配體選自W下序列中的任一條:
[0010] 609:如沈910^:2所示;
[0011] G012:如沈Q ID N0:1 所示;
[0012] 6017:如沈910備:4所示;
[0013] 6018:如沈910備:5所示;
[0014] 6034:如沈910備:6所示;
[001引 6037:如沈910備:3所示。
[0016] 本發(fā)明的第二方面在于提供W上述單鏈DNA適配體為基礎(chǔ),通過截短的方法進行 優(yōu)化得到一條特異性結(jié)合GTX1和GTX4親和力更高的適配體,命名為G018-T-d,如SEQ ID NO: 14所示。
[0017] 所述的G018-T-d適配體,在其5'端或3'端可W進行生物素、巧光分子、同位素、電 化學(xué)、酶或琉基等化學(xué)修飾。
[0018] 本發(fā)明的第Ξ方面,是提供了上述適配體在制備樣品中GTX巧日GTX4(GTX1和GTX4) 的分離富集試劑中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述適配體在制備漆溝藻毒素1和4檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。 所述的試劑或試劑盒可用于快速檢測水體或水產(chǎn)品中的GTX1和GTX4。
[0020] 本發(fā)明還提供了上述適配體在制備預(yù)防或治療漆溝藻毒素1和4中毒藥物中的應(yīng) 用。所述的藥物也為中和漆溝藻毒素1和4的藥物、或為漆溝藻毒素1和4括抗劑等。所述的藥 物可W緩解、治愈漆溝藻毒素1和4中毒導(dǎo)致的惡屯、、嘔吐、腹瀉、神經(jīng)肌肉麻搏、呼吸無力、 血壓下降、屯、率減慢、屯、律失常等癥狀。
[0021] 本發(fā)明還提供了上述適配體在制備去除水體或水產(chǎn)品中漆溝藻毒素1和4制劑中 的應(yīng)用。所述的制劑可W完全去除水體或水產(chǎn)品中的漆溝藻毒素1和4,或者降低水體或水 產(chǎn)品中漆溝藻毒素1和4的含量使其達到聯(lián)合國衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定及推薦的 標(biāo)準(zhǔn)W下。
[0022] 本發(fā)明鑒于GTX1和GTX4穩(wěn)定性高,水溶性好的結(jié)構(gòu)特點,設(shè)計了基于氧化石墨締 SELEX技術(shù),篩選獲得與GTX1和GTX4高親和力、強特異性結(jié)合的單鏈DNA適配體。運些適配體 作為與GTX1和GTX4特異性結(jié)合的分子識別探針,具有親和力高、特異性強、穩(wěn)定性好、免疫 原性低、易制備、修飾和標(biāo)記等優(yōu)勢??捎糜跇悠分泻哿縂TX1和GTX4的分離富集,GTX1和 GTX4的分析檢測,中和漆溝藻毒素1和4藥物的制備,括抗漆溝藻毒素巧日4藥物的制備,W及 水體中毒素的去除。
[0023] 因此,本發(fā)明的適配體面向?qū)嶋H應(yīng)用具有巨大的潛力。
【附圖說明】
[0024] 圖1是基于氧化石墨締的適配體篩選的示意圖。
[0025] 圖2是每一輪篩選中適配體與祀分子GTX1和GTX4的結(jié)合率。
[0026] 圖3是G018的截短序列經(jīng)mfold軟件預(yù)測得到的二級結(jié)構(gòu)圖。
[0027] 圖4是適配體G018-T-d親和力和特異性鑒定圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,運些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人, 分子克?。簩嶒炇抑改希∟ew York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數(shù)按重量計算。除 非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此 夕h任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實 施方法與材料僅作示范之用。
[0030] 實施例1.隨機ssDNA文庫及其引物的構(gòu)建
[0031 ] 1.構(gòu)建長度為80個核巧酸的隨機ssDNA文庫
[0032] 5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3';其中,N代表堿基A,T, C,G中任一個,N40代表長度為40bp的隨機序列。
[0033] 2.引物的構(gòu)建
[0034] 上游引物:5'-46〔46〔4〔464661^464了6-3',沈9 10備:15 [003引 下游引物1:5' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3',SEQ ID NO: 16
[0036] 下游引物2:5' -poly(dA20)-Spacerl8-