神經(jīng)肽Natalisin和其受體基因及在桔小實蠅特異性控制劑中的應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體設及一種神經(jīng)膚化talisin和其受體基因及在枯 小實蛹特異性控制劑中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 相橘是重要的經(jīng)濟作物，隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，相橘產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴大，已 經(jīng)逐漸成為多地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)?？菪嵱?Bac化ocera dorsalis)由于其極強的環(huán)境適應 能力和入侵擴散能力，嚴重危害多種重要經(jīng)濟果蔬，尤其是相橘。目前，枯小實蛹已成為相 橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的巨大威脅。目前，枯小實蛹已對市面上的有機憐殺蟲劑、擬除蟲菊醋和阿 維菌素等農(nóng)藥產(chǎn)生了嚴重的抗藥性;農(nóng)藥殘留嚴重污染環(huán)境，對食品安全造成了隱患;農(nóng)藥 的特異性較低，威脅到有害生物天敵，有加劇農(nóng)業(yè)有害生物爆發(fā)的風險。
[0003] 化talisin(NTL)信號傳遞系統(tǒng)是一個全新的神經(jīng)膚信號傳遞系統(tǒng)。其受體 (化 1:alisin receptor,NTLR)是G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled recepto;r，GPCR)。在 果蛹中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)敲除化化lisin后，果蛹成蟲交配欲望顯著降低。另外，通過RNAi沉 默赤擬谷盜化talisin或者其受體后，雌蟲交配后產(chǎn)卵力顯著下降，表明化talisin通過其 受體調(diào)控著昆蟲的交配行為W及生殖力。GPCR業(yè)已成為藥物研發(fā)的重要祀標體系，50% W 上的臨床用藥W及正在研發(fā)中的藥物作用于GPCR，據(jù)美國華爾街日報曾經(jīng)統(tǒng)計，全球20種 最楊銷藥物中有12種WGPCR為祀標，每年的銷售總額達500多億美元。然而目前昆蟲中的 GPCR作為農(nóng)藥祀標鮮有報道，在枯小實蛹中的應用更是鮮有。WNatalisin受體作為潛在祀 標創(chuàng)制害蟲特異的殺蟲劑來達到控制枯小實蛹的方法受到越來越多的重視，也具有良好的 應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供神經(jīng)膚化talisin和其受體基因及在枯小實蛹特異性控制劑 中的應用。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種枯小實蛹神經(jīng)膚化talisin基因及其編碼的蛋白 質(zhì)，所述枯小實蛹神經(jīng)膚化talisin基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:9所示，其編碼的蛋白 質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0006] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種枯小實蛹神經(jīng)膚Na化lisin基因的擴增方法，包括 如下步驟:提取枯小實蛹總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，WcDNA為模板采用巢式PCR的擴增方法，第 一輪擴增的引物為化talisin-1-F和化化lisin-1-R，第二輪擴增的引物為化talisin-2-F 和Na化1 i S in-2-R，所述引物的序列為：
[0007] Na化1i S i η-1-F:GAGCCGAAAACCGAGAAAAC，
[0008] Na化1isin-1-R:CCACCAGTGGCAACATTAAAC，
[0009] Na化1i s in-2-F:GAAAACGGCATGAAGATCAC，
[0010] Na化1 is in-2-R:GCAACATTAAACTTTATATGCCG。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種枯小實蛹神經(jīng)膚化talisin成熟膚（也稱NTLR配 體)基因及其編碼的蛋白質(zhì)，所述枯小實蛹神經(jīng)膚化talisin成熟膚的核巧酸序列如SEQ ID NO: 11~13所示，所述核巧酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 14~16所 /J、- 〇
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種枯小實蛹神經(jīng)膚化talisin受體基因及其編碼的 蛋白質(zhì)，所述枯小實蛹神經(jīng)膚Na化lisin受體基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 17所示，其編 碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種枯小實蛹神經(jīng)膚Na化lisin受體基因的擴增方法， 包括如下步驟:提取枯小實蛹總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，WcDNA為模板采用巢式PCR的擴增方 法，第一輪擴增的引物為NTLR-1-F和NTLR-1-R，第二輪擴增的引物為NTLR-2-F和NTLR-2-R， 所述引物的序列為：
[0014] NTLR-1-F:TTATTTAGTTGTGCGGTAAAGGT，
[0015] NTLR-1-R:CCGAATGTATAAGGTATACTTAATGAA，
[0016] NTLR-2-F：GGTAAAGGTACGGTTAATTGTC,
[0017] NTLR-2-R:CAAATGCATATATGTATATGTATGTA。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種前述的枯小實蛹神經(jīng)膚化talisin基因及其編碼 的蛋白質(zhì)、枯小實蛹神經(jīng)膚化化lisin成熟膚基因及其編碼的蛋白質(zhì)、或者枯小實蛹神經(jīng)膚 Natalisin受體基因及其編碼的蛋白質(zhì)，在實蛹神經(jīng)調(diào)節(jié)方面的應用，在實蛹防治上的應 用，或者在制備實蛹殺蟲劑方面的應用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的枯小實蛹神經(jīng)膚NTLR配體多膚與NTLR具有很 好的結(jié)合能力，證明本發(fā)明提供的配體具有體外活性，提供的配體多膚和編碼該配體多膚 的DNA可W用于針對該GPCR開發(fā)藥物，例如枯小實蛹神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。通過利用按照本發(fā)明的重 組G蛋白-偶聯(lián)受體蛋白的表達的受體結(jié)合測定系統(tǒng)，可W篩選對枯小實蛹特異性的激動劑 和括抗劑(對模式配體有促進作用的為激動劑，反之，起括抗作用的為括抗劑），所獲得的激 動劑或括抗劑可W用于枯小實蛹的防治，在制備實蛹殺蟲劑方面有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1為枯小實蛹神經(jīng)膚Na化lisin成熟膚對Na化lisin受體的活性測定結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0021] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 主要試劑及生產(chǎn)者：
[0023] 2 XPrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0024] RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司，中國）
[00巧]pGEM-T Easy VectoHPromega公司，美國）
[00%] DNA連接試劑盒(Takara公司，日本）
[0027] Trans5a感受態(tài)細胞（Transgen公司，中國）
[002引 DNA回收試劑盒(Takara公司，日本）
[0029] pcDNA3.1( + )質(zhì)粒（Invitrogen公司，美國）
[0030] 酶Notl(肥B公司，美國）
[0031] 質(zhì)粒DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國）
[0032] DMEM/F-12medium(Gibco公司，美國）
[0033] T4DNA連接酶（Takara公司，日本）
[0034] 基因組DNA提取試劑盒(天根公司，中國）
[0035] 水母素 Aequorin質(zhì)粒由美國堪薩斯州立大學提供
[0036] ViaFect轉(zhuǎn)染試劑(Promega公司，美國）
[0037] 腔腸素 Coelanterazine Η儲存溶液(Xife-technologies公司，美國）
[0038] 本發(fā)明實施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0039] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
[0040] 實施例一、枯小實蛹神經(jīng)膚Natalisin及其受體的開放閱讀框序列的獲得
[0041] 1、枯小實蛹神經(jīng)膚Na化lisin及其受體的開放閱讀框序列引物設計及擴增
[0042] 基于基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學方法，經(jīng)過對果蛹化化lisin(Genbank 齡.醒001170137)和其化13113111受體(66扣3扯齡.〔66515)反復分析及比對，設計枯小實 蛹神經(jīng)膚Na化lisin及其受體的巢氏PCR特異性引物，序列如下：
[0043]
[0044] 用RNA提取試劑盒提取枯小實蛹總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0045] 擴增枯小實蛹神經(jīng)膚Natalisin序列：50ul的反應體系包含24化去離子水，2化L 2 XPrimeSTAR Max Premix,引物 Natalisin-1-F(如序列表中 SEQ ID N0:1 所示）、 Natalisin-1-R(如序列表中SEQ ID N0:2所示)各化L(濃度均為ΙΟμΜ),化L枯小實蛹cDNA模 板。第一輪PCR擴增條件如下:預變性:98°C反應2min，隨后，98°C變性10s，55°C退火15s，72 °C延伸1.5min，循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。取第一輪PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物2化作為 第二輪口〔巧廣增的模板，擴增引物用化*曰113111-2斗（如序列表中569 10^):3所示）和 Natalisin-2-R(如序列表中SEQ ID N0:4所示），50ul的反應體系的其余組分與第一輪擴增 時相同，第二輪PCR擴增條件與第一輪相同。
[0046] 擴增枯小實蛹神經(jīng)膚Na化lisin受體序列：50ul的反應體系，W及第一、二輪的PCR 擴增條件與前述擴增化talisin序列時相同，只需將第一輪的引物換為NTLR-1-F(如序列表 中SEQ ID N0:5所示）、NTLR-1-R(如序列表中SE