一種提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種提高水稻稻攝病抗性 的基因0s02g0532500、蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由真菌Magnaporthe grisea巧eberOBarr引起的水稻稻攝病是世界各稻區(qū)危害 最嚴(yán)重的水稻病害之一，對全球稻作栽培產(chǎn)生毀滅性的影響。稻攝病在水稻生長各個(gè)時(shí)期 都可能發(fā)生，尤W葉攝和穗攝的危害最大。全球每年因稻攝病造成的產(chǎn)量損失達(dá)11~30%， 直接經(jīng)濟(jì)損失約50億美元，損失的糧食足W養(yǎng)活6000萬人口。在我國，凡有水稻栽培的地方 都有稻攝病發(fā)生。南北稻區(qū)每年均受到不同程度危害，一般減產(chǎn)10~20%，重的達(dá)40~ 50%，局部田塊甚至顆粒無收。
[0003] 目前，利用品種的抗性，開展稻攝病抗性育種被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境友好的 防治途徑。近年來，育種學(xué)家們利用常規(guī)育種技術(shù)培育出了許多水稻稻攝病抗病品種。但 是，大部分抗病品種推廣應(yīng)用2~3年后即喪失其稻攝病抗性。如高抗稻攝病品種"窄葉青8 號"推廣種植不到Ξ年便喪失抗性，高產(chǎn)抗病優(yōu)質(zhì)品種"梗釉89"推廣不到四年，其抗病性也 明顯下降。由此可見，水稻品種稻攝病抗性周期短是水稻生產(chǎn)中一個(gè)普遍而突出的問題，延 長水稻品種稻攝病的持性壽命已成為我國乃至各水稻生產(chǎn)國水稻改良中需要優(yōu)先解決的 問題。
[0004] 對稻攝病持久抗性品種Moroberekan、谷梅2號和Ξ黃占2號的抗病遺傳分析結(jié)果 表明，稻攝病持久抗性由質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性兩部分組成。由主效基因控制的稻攝病抗性 稱為質(zhì)量抗性(完全抗性），其表現(xiàn)為水稻寄主與稻攝病菌的不親和性，具有小種?；浴Ｔ?W往的稻攝病抗性育種中往往只利用了個(gè)別的主效基因。運(yùn)些品種大面積推廣應(yīng)用時(shí)，一 旦遇到新的小種或病原菌毒性產(chǎn)生變異時(shí)就會喪失其抗病性。運(yùn)是造成水稻品種稻攝病抗 性周期短的根本原因。與之相對應(yīng)的是數(shù)量抗性(部分抗性），有多個(gè)微效基因組成。數(shù)量抗 性表現(xiàn)為寄主與病菌的親和性，抑制稻攝病菌繁殖，延緩發(fā)病進(jìn)程，在形態(tài)上表現(xiàn)為葉片的 病斑數(shù)少、病斑小。由于數(shù)量抗性的小種?；圆粡?qiáng)，或由于其微效多基因的性質(zhì)不容易被 稻攝病菌克服，因此數(shù)量抗性被認(rèn)為與水稻稻攝病持久抗性緊密相關(guān)，已成為研究的熱點(diǎn) 和前沿。
[0005] 隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和水稻抗病功能基因組的深入開展，國際上迄今已鑒定 和定位了 300多個(gè)稻攝病數(shù)量抗性QTL，但是，盡管已標(biāo)記鑒定出眾多的稻攝病數(shù)量抗性 QTL，水稻稻攝病數(shù)量抗性分子育種很少有成功的報(bào)道。其主要原因一方面在于數(shù)量抗性的 微效多基因的性質(zhì)，另一方面QTL作圖的不精確性。應(yīng)用QTL作圖方法標(biāo)記定位的QTL區(qū)間一 般在10~30cM。在運(yùn)一區(qū)間有數(shù)W百計(jì)基因的存在。分子標(biāo)記選擇時(shí)往往受到親本多態(tài)性 和重組的影響，使得稻攝病數(shù)量抗性分子育種很難有效進(jìn)行?？梢?，鑒定稻攝病數(shù)量抗性的 功能基因，是水稻稻攝病數(shù)量抗性和持久抗性分子育種取得突破的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種提高水稻穗攝抗性的 基因0s02g0532500、蛋白及其應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了如下具體的技術(shù)方案：
[000引一種提高水稻稻攝病抗性的基因0s02g0532500,所述基因具有如SEQ ID No:l所 示的核巧酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種提高水稻稻攝病抗性的蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No:2 所示的氨基酸序列。
[0010] 在其中一些實(shí)施例中，所述提高水稻稻攝病抗性的蛋白由如SEQ ID No: 1所示的 核巧酸序列編碼。
[0011] 本發(fā)明還提供了提高水稻稻攝病抗性的基因0s02g0532500在提高水稻稻攝病抗 性方面的應(yīng)用。
[0012] 由于控制稻攝病數(shù)量抗性的基因多，單個(gè)基因的效應(yīng)小，很難應(yīng)用圖位克隆的策 略克隆其功能基因。近年來，越來越多的研究表明，防衛(wèi)基因化efense response，DR gene) 與數(shù)量抗病性密切相關(guān)。本發(fā)明申請人前期用防衛(wèi)基因?qū)λ镜緮z病數(shù)量抗性的研究結(jié)果 表明，防衛(wèi)基因與稻攝病數(shù)量抗性密切相關(guān)，其中5個(gè)防衛(wèi)基因與稻攝病數(shù)量抗性QTL共定 位，并進(jìn)一步通過基因沉默技術(shù)驗(yàn)證位于第8染色體的稻攝病數(shù)量抗性QTL區(qū)間內(nèi)的防衛(wèi)基 因草酸氧化酶類蛋白（GLP)基因家族具有稻攝病數(shù)量抗性功能。應(yīng)用候選防衛(wèi)基因進(jìn)行稻 攝病數(shù)量抗性分析將是分離、鑒定水稻稻攝病功能基因一個(gè)很好的策略。
[0013] 草酸氧化酶類蛋白，又稱類胚素蛋白（germin-1化e protein，GLP)，在植物的生長 發(fā)育W及逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，是一種重要的防衛(wèi)基因。草酸氧化酶屬于草酸降解 酶之一，廣泛存在于高等植物(水稻、小麥等）W及細(xì)菌、真菌和苔薛中，它的作用是氧化草 酸產(chǎn)生此化和C〇2,遏制病原菌的侵染，因此在植物的逆境脅迫及抗病防御中發(fā)揮著重要功 能。本發(fā)明申請人采用候選基因的方法篩選與水稻稻攝病葉攝數(shù)量抗性相關(guān)的基因時(shí)，發(fā) 現(xiàn)在水稻第8染色體的化P基因與葉攝數(shù)量抗性密切相關(guān)，對減少病葉面積的貢獻(xiàn)率達(dá)到 30.0 %。用基因沉默的方法沉默了整個(gè)第8染色體化P基因家族之后，水稻葉片對稻攝病菌 的感病性明顯增加。在進(jìn)一步篩選與水稻葉攝抗性和穗攝抗性相關(guān)的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，另一位 于水稻2號染色體的一個(gè)化P基因0s02g0532500,在葉攝和穗攝接種后其表達(dá)量顯著上調(diào)。 因此該基因可能在水稻稻攝病抗性中發(fā)揮了重要作用。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0015] 1.本發(fā)明首次證明了水稻化P基因0s02g0532500是水稻稻攝病抗性的功能基因， 該基因的克隆和生物學(xué)功能驗(yàn)證對于水稻稻攝病抗性的分子機(jī)制研究有重要的參考意義；
[0016] 2.本發(fā)明提供了利用Camv35S啟動(dòng)子過表達(dá)0s02g0532500基因的水稻轉(zhuǎn)化過表達(dá) 載體。該載體轉(zhuǎn)化水稻后能大幅提高0s02g0532500的表達(dá)量，伴隨著表達(dá)量的提高，轉(zhuǎn)化植 株的稻攝病抗性明顯增強(qiáng)，并且轉(zhuǎn)基因植株在生長狀態(tài)及農(nóng)藝性狀上沒有明顯的改變。因 此，本發(fā)明通過化mv35S啟動(dòng)子過表達(dá)0s02g0532500的技術(shù)可W應(yīng)用于水稻的基因遺傳工 程育種，并能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，改良水稻的稻攝病抗性，從而保障目前水稻病害頻發(fā)的 氣候條件下的水稻生產(chǎn)安全。
【附圖說明】
[0017]圖巧實(shí)施例1中所使用的過表達(dá)載體P冊SN載體圖譜；
[0018] 圖2為實(shí)施例2的轉(zhuǎn)基因植株中0s02g0532500表達(dá)水平檢測圖；
[0019] 圖3為實(shí)施例3中過表達(dá)0s02g0532500對水稻植株的葉攝抗性的影響，其中**表示 與對照相比存在極顯著差異；
[0020] 圖4為實(shí)施例3中過表達(dá)0s02g0532500對水稻植株的穗攝抗性的影響，其中**表示 與對照相比存在極顯著差異。
【具體實(shí)施方式】
[0021] W下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未 注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，所采用的技術(shù)手段通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0022] 實(shí)施例1提高水稻稻攝病抗性的基因及過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0023] (1)、取水稻稻攝病高抗品種Ξ黃占2號（SHZ-2)的幼苗葉片部位，用Tr i Zo 1 Reagent(Invitrogen公司，其貨號為：15596026)提取葉片總RNA，采用甲醒變性凝膠電泳和 紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度及量；
[0024] (2)、取化g的總RNA做起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶為PrimeScript(TAKARA 公司），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟參考該逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說明。W逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用引物:F， CCGGAATTCAGTGACAGAACGAGCGTAGAAT(SEQ ID No:3);R， GGAAGATCTTCACTAACGGGGAGTAACCTAA(SEQ ID No:4)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR所用的聚合酶為KOD FX(Toyok)公司）。反應(yīng)體系為50化，按照KOD FX的說明書配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為:9