特異啟動(dòng)子NtR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在花生發(fā)狀根系產(chǎn)白藜蘆醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及特異啟動(dòng)子化R2驅(qū)動(dòng)AhRESS在花生發(fā)狀根系產(chǎn)白襲蘆醇的方法，屬于 分子生物學(xué)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 白襲蘆醇(Resveratrol，簡(jiǎn)稱Res),是一種重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、 花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤為豐富。它具有多種生物活性，是一種天然的 抗氧化劑，可W降低血脂，抑制血小板凝結(jié)，抗癌，抗炎，抗福射，抗衰老，防治屯、血管疾病 等。它與紫杉醇都被譽(yù)為綠色抗癌藥物。但自然界中存在的白襲蘆醇的含量較少，利用植物 基因工程技術(shù)高效生產(chǎn)白襲蘆醇是大量獲得白襲蘆醇的重要途徑。
[0003] 白襲蘆醇廣泛存在于種子植物中，作為巧類(lèi)次生代謝物，主要通過(guò)苯丙氨酸代謝 途徑合成的。劉蕾等克隆了白襲蘆醇合酶cDNA，并將其轉(zhuǎn)化花生的下胚軸、胡蘿h的下胚軸； 同時(shí)，也把花生RESS轉(zhuǎn)化酵母。許玉芬等成功構(gòu)建了花生白襲蘆醇合酶基因的酵母表達(dá)載 體，并通過(guò)電穿孔法將其整合到畢赤酵母的染色體上;成功構(gòu)建了由化i啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的花生 白襲蘆醇合酶基因單子葉植物表達(dá)載體，分別利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)導(dǎo)甘薦。 黃國(guó)強(qiáng)等研究了白襲蘆醇合酶基因在花生根中的特異表達(dá)，研究結(jié)果表明：該基因的轉(zhuǎn)錄 表達(dá)在根的初皮部，其他組織中未見(jiàn)表達(dá);酵母浸提液處理可使該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯增 強(qiáng)。林榮華等W花生中的白襲蘆醇合酶基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建了含目的基因的植物重組表 達(dá)載體地6RS，利用電穿孔法將PB6RS質(zhì)粒直接導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo) 將地6RS轉(zhuǎn)化煙草(云煙85)，得到了陽(yáng)性植株。
[0004] 由于白襲蘆醇的重要生理功能，近幾年，人們開(kāi)始研究利用生物技術(shù)提高植物材 料中白襲蘆醇的含量。Giovinazzo等研究者W35S啟動(dòng)子調(diào)控白襲蘆醇合酶基因進(jìn)行番茄 遺傳轉(zhuǎn)化，測(cè)定轉(zhuǎn)基因番茄中的抗壞血酸鹽與谷脫甘膚還原酶的總體水平，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基 因植物的抗氧化性較之野生型植物的抗氧化性有了顯著的提高。冊(cè)sken等利用油菜種子特 異表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白襲蘆醇合酶基因表達(dá)，轉(zhuǎn)化油菜，同時(shí)，阻斷消耗白襲蘆醇合酶底物的 另一條支路，檢測(cè)To代油菜種巧中的Res含量，發(fā)現(xiàn)W鮮重計(jì)其最高含量為361 yg/g，同時(shí) 還獲得了品質(zhì)改善且保健性提高的油菜種巧。但目前，通過(guò)根特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白襲蘆醇合 酶基因表達(dá)生產(chǎn)白襲蘆醇的研究未見(jiàn)報(bào)道。
[000引發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是一種革蘭氏陰性±壤細(xì)菌，它能夠侵 染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及裸子植物，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生發(fā)狀根(毛狀根）。發(fā)狀 根相對(duì)于正常的根，有很多優(yōu)點(diǎn)。理論上，發(fā)狀根來(lái)源于一個(gè)植物細(xì)胞，不是嵌合體，所W其 遺傳性狀穩(wěn)定，繼代多次仍然具有原始發(fā)狀根的遺傳特性;發(fā)狀根能夠在無(wú)外源激素的培 養(yǎng)基中自主生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度快，易操作和調(diào)控，不受季節(jié)和地域限制;某些次生代謝產(chǎn)物 在發(fā)狀根中含量比正常根高。因此，利用發(fā)狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是一條可靠和有效的途 徑。
[0006] 在花生各組織中，白襲蘆醇W根中的含量最高。因此，快速獲得大量根，既獲得了 植源性的白襲蘆醇材料，進(jìn)而可W大量提取白襲蘆醇。而發(fā)根農(nóng)桿菌可W侵染植物，在傷口 處形成發(fā)狀根，且發(fā)狀根無(wú)激素依賴性，又可W快速生長(zhǎng)，在短時(shí)間內(nèi)增長(zhǎng)數(shù)百倍甚至上千 倍?；诖耍琖發(fā)狀根液體培養(yǎng)是快速大量生產(chǎn)白襲蘆醇的一條捷徑。劉杰等優(yōu)化了發(fā)狀根 的培養(yǎng)條件，并初步探索了誘導(dǎo)發(fā)狀根產(chǎn)生白襲蘆醇的條件，研究結(jié)果表明：花生發(fā)根的最 適基本液體培養(yǎng)基為無(wú)激素的MS培養(yǎng)基，添加植物激素會(huì)不同程度的抑制發(fā)狀根的生長(zhǎng)， 100 ymol/L水楊酸(SA)可W提高花生發(fā)狀根白襲蘆醇巧合成分泌W及白襲蘆醇的合成。 黃麗萍等探究了不同發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化不同品種煙草發(fā)根效率的差異，結(jié)果表明：不同煙草 品種和發(fā)根農(nóng)桿菌菌株均顯著影響毛狀根的誘導(dǎo)率。Fabricio等研究發(fā)現(xiàn)，花生發(fā)狀根可 W高效產(chǎn)生白襲蘆醇，不同生長(zhǎng)階段的發(fā)狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生白襲蘆醇含量不同，且在合適的生 長(zhǎng)階段，一定濃度的醋酸鋼誘導(dǎo)發(fā)狀根24 h，白襲蘆醇會(huì)被分泌到液體培養(yǎng)基中。但目前， 通過(guò)根特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白襲蘆醇合酶基因在花生發(fā)狀根表達(dá)生產(chǎn)白襲蘆醇的研究未見(jiàn)報(bào) 道。
[0007] 本發(fā)明針對(duì)W上研究背景，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)pBI121-NTR2-AhRESS遺傳轉(zhuǎn)化花 生，獲得根特異啟動(dòng)子NTR2驅(qū)動(dòng)AhRESS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因花生發(fā)狀根，通過(guò)發(fā)狀根液體懸浮培 養(yǎng)，快速大量獲得發(fā)狀根，進(jìn)而用于白襲蘆醇的生產(chǎn)。該發(fā)明為利用煙草根特異啟動(dòng)子NTR2 驅(qū)動(dòng)花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS在花生發(fā)狀根中特異表達(dá)，進(jìn)而生產(chǎn)白襲蘆醇提供了良 好的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了特異啟動(dòng)子化R2驅(qū)動(dòng)AhRESS在花生發(fā)狀根系產(chǎn)白襲蘆醇的方法。目 的在于提供煙草根特異啟動(dòng)子NTR2驅(qū)動(dòng)花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS在花生發(fā)狀根中特 異表達(dá)，進(jìn)而生產(chǎn)白襲蘆醇的技術(shù)，W便利用植物基因工程手段高效生產(chǎn)白襲蘆醇。
[0009] 一種煙草根特異啟動(dòng)子NTR2驅(qū)動(dòng)AhRESS在花生發(fā)狀根系大量合成白襲蘆醇的技 術(shù)及應(yīng)用，包括W下步驟： (1) 克隆煙草根特異啟動(dòng)子化R2和花生AhRESS基因； (2) 煙草根特異啟動(dòng)子化R2驅(qū)動(dòng)花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS表達(dá)載體地I121-NtR2-AhRESS的構(gòu)建； (3) 轉(zhuǎn)地I121-NTR2-AhRESS花生發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng)； (4) 轉(zhuǎn)地I121-NTR2-AhRESS花生發(fā)狀根白襲蘆醇含量的檢測(cè)。
[0010] 所述步驟（1)中pBim-NTR2-AhRESS載體中煙草根特異啟動(dòng)子NTR2的序列為SEQ ID No: 1，花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS的序列為SEQ ID No:2。
[0011] 所述步驟(3)中發(fā)根農(nóng)桿菌為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)所贈(zèng)送的發(fā)根農(nóng)桿菌，其介導(dǎo)的花生 遺傳轉(zhuǎn)化外植體分別為葉片、子葉、上胚軸和下胚軸外植體。
[0012] 所述步驟(4)中轉(zhuǎn)地I121-NTR2-AhRESS花生發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基巧00 mg/L Cef，第一次繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+300 mg/L Cef，第二次繼代培養(yǎng)基 為MS培養(yǎng)基+100 mg/L Cef，第Ξ次繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基;Ξ次繼代后頭抱霉素濃度降至 0。
[0013] 所述步驟（5)中轉(zhuǎn)pBI121-NTR2-AhRESS花生發(fā)狀根白襲蘆醇含量的檢測(cè)方法為 HPLC，色譜條件為:色譜柱ODS (250 mmX4.6 mmX5皿），流動(dòng)相乙臘:水(25:75)，流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm，柱溫25°C，進(jìn)樣量10化。
[0014] 具體為； 1.煙草根特異啟動(dòng)子化R2驅(qū)動(dòng)花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS表達(dá)載體地I121-NtR2-AhRESS的構(gòu)建。
[0015] (1)克隆煙草根特異啟動(dòng)子化R2,并連接至PMD18-T載體中，得到PMD18-化R2載 體； (2 )地1121 -NtR2-GUSA載體構(gòu)建:利用限制性內(nèi)切酶BamHI及Sac I對(duì)地1121質(zhì)粒載體進(jìn) 行酶切，切除該載體上的GUSA基因，利用帶有限制性酶切位點(diǎn)的特異引物從PCAMBIA1301載 體中克隆GUSA基因，連接至酶切后的PBI121載體上，得到PBI121-GUSA載體；將所述的 地1121-GUSA載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切除35S啟動(dòng)子，將pMD18-NtR2載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，將化R2 啟動(dòng)子連接至地1121 -GUSA載體中，得到地1121 -NtR2-GUSA載體； (3)地I121-NtR2-AhRESS載體的構(gòu)建:克隆花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS基因，并連接 到地1121 -NtR2-GUSA載體中，得到地1121 -NtR2-AhRESS載體。
[0016] 2.煙草根特異啟動(dòng)子NTR2驅(qū)動(dòng)花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS表達(dá)載體pBim- NTR2-AhRESS經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化花生。
[0017] 在發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生發(fā)狀根的基礎(chǔ)上，利用地I121-NTR2-AhRESS載體轉(zhuǎn)化 發(fā)根農(nóng)桿菌，通過(guò)其介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化花生，獲得轉(zhuǎn)基因花生發(fā)狀根。WCTAB法提取轉(zhuǎn)基因花生 及對(duì)照的發(fā)狀根的DNA，分別 WAhRESS基因（AhRESS-F: 5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和 AhRESS-R： 5 ' TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）和rol B 基因 （rol B-F:5' GTCCTTGCAGTGCTAGATTT 3 ' 和rol B-R: 5 ' GAAGGTGCAAGCTACCTCTC3 '）的上、下游引物進(jìn)行 PCR;WCTAB法提取轉(zhuǎn)基因花生及對(duì)照的發(fā)狀根的RNA，按照PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)逆 轉(zhuǎn)錄后，WAhRESS基因特異引物(AhRESS-F: 5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 '