以多重dna片段為模板制備rna或dna探針的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸診斷領(lǐng)域，具體設(shè)及一種RNA或DNA探針標(biāo)記的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧光原位雜交技術(shù)化lu或escence in si1:u hybridization,FISH)是一種重要的 非放射性原位雜交技術(shù)，巧光染料標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的祀DNA或RNA分子雜 交，如果被檢測(cè)的染色體祀DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性， 由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可W直接與染色體進(jìn)行 雜交從而將特定的基因在染色體上定位。通過在巧光顯微鏡下觀察巧光信號(hào)，W確定與特 異探針雜交后結(jié)合了巧光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細(xì)胞器中的定位，對(duì)待 測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。
[0003] 巧光原位雜交技術(shù)(FISH)具有很多優(yōu)點(diǎn)，主要體現(xiàn)在：（1)無需放射性同位素標(biāo) 記，安全性較高；（2)FISH的實(shí)驗(yàn)周期短，探針穩(wěn)定性強(qiáng)；（3)通過多次免疫化學(xué)反應(yīng)，使其雜 交信號(hào)放大，提高靈敏度，檢測(cè)的靈敏度接近同位素探針雜交；（4)FISH的分辨率高達(dá)3-20Mb; (5)FI細(xì)可W用不同修飾核巧酸分子標(biāo)記不同的探針，即可W制備成多色探針，因此 可W在同一張切片上同時(shí)觀察幾種探針的定位，直接得到它們的相關(guān)位置和順序，加速功 能基因定位和生物基因組的研究。
[0004] FISH技術(shù)已經(jīng)在基因定位、基因作圖、基因擴(kuò)增和缺失的檢測(cè)、產(chǎn)前診斷、哺乳動(dòng) 物染色體進(jìn)化研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是在腫瘤診斷方面，F(xiàn)ISH技術(shù)被廣泛用于 乳腺癌、膀脫癌、肺癌、淋己瘤等實(shí)體瘤的早期診斷、療效檢測(cè)、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等幾 個(gè)方面。研究表明，一些基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
[0005] 巧光原位雜交(FISH)-般是應(yīng)用DNA探針進(jìn)行檢測(cè)，DNA探針可W檢巧陽NA樣本(基 因組DNA)，也可W檢測(cè)RNA樣本(mRNA或ncRNA) dDNA探針穩(wěn)定性好，易于保存。RNA探針一般 用于檢巧化NA樣本(mRNA或ncRNA) dRNA探針的優(yōu)點(diǎn)在于是單鏈探針，雜交效率高，且雜交體 較DNA探針穩(wěn)定。在巧光原位雜交中，可W跟據(jù)各自探針的優(yōu)點(diǎn)及檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種W多重DNA片段為模板制備RNA或DNA探針的方法，該方 法能有效地大量制備特異性強(qiáng)、靈敏度高和穩(wěn)定性強(qiáng)的RNA或DNA探針，W滿足生產(chǎn)FIS則中 瘤檢測(cè)試劑盒的需求。
[0007] 本發(fā)明所述的W多重DNA片段為模板制備RNA或DNA探針的方法，包括W下步驟:A. 從體外轉(zhuǎn)錄的基因特異性cDNA或是基因組中特定基因 DNA序列中篩選出多個(gè)祀序列，對(duì)于 每個(gè)祀序列設(shè)計(jì)至少一對(duì)引物，所述引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為多重DNA片段，所述多重DNA片段 能包括所有祀序列;B. W所述多重DNA片段為模板，進(jìn)行W下反應(yīng):a.加入RNA聚合酶和帶有 生物素標(biāo)記的UTP進(jìn)行反應(yīng)，將UTP滲入產(chǎn)物，純化后得到RNA探針;或者b.加入DNA聚合酶和 帶有生物素或蛋光標(biāo)記的加 TP進(jìn)行反應(yīng)，將加 TP滲入產(chǎn)物，純化后得到DNA探針。
[000引探針標(biāo)記常用的RNA聚合酶包括:Τ7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、Τ3 RNA聚合酶和 Trc RNA聚合酶。
[0009] 探針標(biāo)記常用的DNA聚合酶包括:DNA聚合酶I、DNA聚合酶Klenow片段、Taq DNA聚 合酶及其他用于PCR中的DNA聚合酶。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法的進(jìn)一步特征，所述的步驟A中，所述 篩選包括:查找待檢測(cè)特定mRNA，或者查找基因組中特定基因 DNA序列，排除其它非特異性 序列；然后，篩選2-50個(gè)無內(nèi)含子和重復(fù)序列特定序列區(qū)域，根據(jù)需要可選擇同源區(qū)域序 列，作為祀序列。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法的進(jìn)一步特征，所述的步驟A中，所述 引物設(shè)計(jì)包括:所選的每個(gè)區(qū)域各設(shè)計(jì)至少一對(duì)引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為lOO-lOOObp。 [00 12]根據(jù)本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法的進(jìn)一步特征，所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，引物的5'端加上T7啟動(dòng)子序列。
[OOU]根據(jù)本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法的進(jìn)一步特征，所述RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上SP6啟動(dòng)子序列。
[0014]根據(jù)本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法的進(jìn)一步特征，所述RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，引物的5'端分別加上T3啟動(dòng)子序列。
[001引根據(jù)本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法的進(jìn)一步特征，所述RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5'端分別加上Trc啟動(dòng)子序列。
[0016] T7啟動(dòng)子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[0017] SP6啟動(dòng)子序列：5 ' -CATACGATTTAGGTGACACTATA-3'
[001 引 T3啟動(dòng)子序列：5 ' -AATTAACCCTCACTAAAG-3'
[0019] Trc啟動(dòng)子序列：5'-TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3'
[0020] 上述四種RNA聚合酶與相應(yīng)啟動(dòng)子的組合為同類型的設(shè)計(jì)，可W替換使用。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種快速檢測(cè)癌癥相關(guān)的細(xì)胞因子的試劑盒。
[0022] 本發(fā)明所述的快速檢測(cè)癌癥相關(guān)的細(xì)胞因子的試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明所述的方 法所制備的RNA或DNA探針。
[0023] 本發(fā)明是WcDNA序列為模板，利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過與基因文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)而 鱗選出來的作為探針標(biāo)記的模板序列。多重DNA片段是指用2個(gè)或W上的DNA片段去涵蓋及 取代全長(zhǎng)基因的cDNA序列，運(yùn)些針對(duì)某個(gè)基因的多個(gè)DNA片段序列不僅能充分體現(xiàn)該基因 的特異性及代表性，而且能避免一些重復(fù)序列或同源序列W有針對(duì)性地增強(qiáng)探針的特異 性。
[0024] 本發(fā)明首次用多重DNA片段作為模板，針對(duì)待檢測(cè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物，并在反 向引物5'端加上啟動(dòng)子或RNA聚合酶結(jié)合序列，W使最終得到的RNA探針能夠全部覆蓋所有 祀序列。本發(fā)明探針制備方法簡(jiǎn)化了探針制備步驟，大幅度縮短整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，更重要的 是，探針特異性和穩(wěn)定性更強(qiáng)，降低背景信號(hào)，靈敏度更高。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了多種 腫瘤初診快速檢測(cè)方面的新用途和相關(guān)的普遍適用的試劑盒。
[0025] 本發(fā)明所述的制備RNA或DNA探針的方法能有效地大量制備特異性強(qiáng)、靈敏度高和 穩(wěn)定性強(qiáng)的RNA或DNA探針。用于腫瘤診斷的RNA探針比DNA探針有更多的優(yōu)勢(shì)，例如:避免了 雙鏈DNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之間易復(fù)性的可能性，提高了雜交反應(yīng)的敏感性;RNA與 RNA之間形成的雜交體比DNA-RNA雜交體更穩(wěn)定；而且，RNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA 酶的影響，因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶處理，W洗脫除去未結(jié)合的探針，可降低本底信號(hào)，因 此有本底低的優(yōu)點(diǎn)。因此，利用本發(fā)明所述方法制備的RNA探針有利于研發(fā)和制備出容易保 存和運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)試劑及試劑盒，尤其是用于診斷和治療多種腫瘤的高品質(zhì)探針及相關(guān)試劑 盒。
[00%]傳統(tǒng)的探針標(biāo)記方法直接WcDNA作為標(biāo)記模板。制備檢測(cè)mRNA的探針時(shí)，一般是 應(yīng)用全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物作為模板，利用RNA聚合酶或DNA聚合酶制備RNA或DNA探 針。但是，大部分基因 cDNA在lOOObpW上，如直接進(jìn)行雜交反應(yīng)會(huì)因探針長(zhǎng)度太長(zhǎng)而不利于 進(jìn)入細(xì)胞和雜交，且會(huì)產(chǎn)生非特異性背景信號(hào)。制備的RNA或DNA探針一般需堿裂解或DNA酶 處理，使探針裂解成lOOObpW下的片段。然而，RNA堿裂解或DNA酶處理過程和程度不易控 審IJ，因此探針質(zhì)量難W保證。
[0027] 本發(fā)明所述的方法的優(yōu)勢(shì)在于:采用包含所述目的序列的多條DNA片段通過一步 反應(yīng)即可制備100-500nt理想長(zhǎng)度的RNA探針，并且可直接用于下一步的雜交試驗(yàn)。探針制 備過程不需要堿裂解等步驟，就可得到長(zhǎng)度均一性好的探針，為雜交試驗(yàn)理想長(zhǎng)度的片段， 因此增強(qiáng)探針特異性，降低背景信號(hào)干擾，并節(jié)約大量實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了試驗(yàn)效率。
[0028] 在DNA和RNA雜交反應(yīng)中，探針的理想長(zhǎng)度為100-500bp(Michael R.Green and Joseph Sambrook,Mo1ecu1ar Cloning:A Lab或at或y Manual.Cold Spring Harb或Lab或 at或y Press;4l:h editionQune 15,2012))。如果探針太短，雜交特異性不高，且雜交不穩(wěn) 定;如果探針太長(zhǎng)，它不易透過細(xì)胞，雜交效率降低，且易產(chǎn)生非特異性背景信號(hào)。
[0029] 現(xiàn)有的RNA或DNA探針標(biāo)記的方法都很難有效地將標(biāo)記好的探針長(zhǎng)度控制在運(yùn)范 圍內(nèi)。因此，現(xiàn)有技術(shù)必須借助堿裂解(RNA探針)或DNA酶(DNA探針)去降解標(biāo)記好的探針W 達(dá)到上述理想長(zhǎng)度。
[0030] PCR反應(yīng)可W精確地控制產(chǎn)物的長(zhǎng)度，但用PCR直接標(biāo)記探針的效率不高，而且很 多用于PCR反應(yīng)的酶都不能有效地將標(biāo)記的加 TP滲入到產(chǎn)物中去。PCR反應(yīng)也不能用于標(biāo)記 RNA探針。
[0031] 本發(fā)明是利用PCR反應(yīng)可W精確控制產(chǎn)物長(zhǎng)度的特點(diǎn)，用其制備多個(gè)的理想長(zhǎng)度 的DNA片段作為模板去標(biāo)記探針，運(yùn)樣在DNA模板水平就有效地控制了標(biāo)記的探針長(zhǎng)度，審U 備的RNA或DNA探針不用RNA堿裂解或DNA酶處理過程而直接用于雜交反應(yīng)。此外，用多個(gè)的 理想長(zhǎng)度的DNA片段作為模板，還能根據(jù)檢測(cè)目的的需要而有效地覆蓋特定的目標(biāo)基因序 列。同時(shí)在每一個(gè)引物末端加上RNA聚合酶結(jié)合序列，使多個(gè)的理想長(zhǎng)度的DNA片段可同時(shí) 在同一標(biāo)記反應(yīng)中作為模板可W制備RNA探針。
[0032] 下表1比較了常規(guī)制備探針的方法與本發(fā)明所述的方法的異同。
[0033]
[0034] 本發(fā)明所述的方法有利于篩選和制備高特異性探針，并可消除非編碼序列及其它 非特異性序列的影響。多重DNA片段的設(shè)計(jì)對(duì)檢測(cè)序列更有針對(duì)性，不僅排除了一些非編碼 序列及其它非特異性序列，也能使探針的特異性大大提高。
[0035] 本發(fā)明所述的方法有利于區(qū)分同源性序列及RNA的不同剪切形式。本發(fā)明多重DNA 片段的設(shè)計(jì)可根據(jù)檢測(cè)對(duì)象來確定加入或刪除一些同源性序列，也可W只包含或不包含不 同剪切形式而達(dá)檢測(cè)特異性目標(biāo)序列的目的。
[0036] 本發(fā)明中設(shè)計(jì)引物時(shí)，在反向引物5'端加上啟動(dòng)子序列或RNA聚合酶結(jié)合序列，可 確保每個(gè)片段都能轉(zhuǎn)錄成探針，針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物，能夠保證探針覆蓋祀基因