一種利用三孢布拉霉菌制備β-胡蘿卜素的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備β-胡蘿卜素的發(fā)酵方法，特別是涉及一種利用三孢布拉霉菌制備β-胡蘿卜素的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β_胡蘿卜素是一種脂溶性不飽和脂肪族碳氫化合物，是類胡蘿卜素族的典型代表，也是自然界中最普遍存在最穩(wěn)定的天然色素，廣泛存在于綠色和黃色蔬菜以及水果中。其分子式為C4qH56，分子量為536.88，外觀呈深紅色至暗紅色，對氧、熱和光不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，不易溶于水、酸和堿，易溶于氯仿、苯和植物油，微溶于乙醇和乙醚。除了常用作著色劑以外，胡蘿卜素還具有多種生物活性，是一種與人體健康密切相關(guān)的藥用有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，由于胡蘿卜素的分子式含有2個β_紫羅酮環(huán)和4個異戊二烯側(cè)鏈，中間斷裂后即產(chǎn)生兩個維生素A分子，在被人體吸收后可以作為維生素A的前體物質(zhì);此外，其分子中含有的不飽和結(jié)構(gòu)使它具有較強的抗氧化活性和清除自由基的能力，能夠有效的預(yù)防、延緩和治療某些疾病，尤其是癌癥，同時也能提高機體的免疫功能。因此，在食品、藥品、化妝品、和保健品行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003]天然來源的β-胡蘿卜素與合成的β-胡蘿卜素相比，由于其來源廣泛、不含致癌物質(zhì)、成本較低且生理活性好，在市場上占有主導(dǎo)地位。近年來，國內(nèi)外天然胡蘿卜素的生產(chǎn)多采用微生物發(fā)酵的方法，利用微生物進行發(fā)酵生產(chǎn)具有生產(chǎn)周期短、過程容易控制、不受地域及氣候的影響、容易進行規(guī)?；僮鞯葍?yōu)勢。在實驗過程中，研究人員已經(jīng)獲得了一些具有生產(chǎn)價值的優(yōu)良菌株，如三孢布拉霉、分歧桿菌、紅假單胞菌及紅法夫酵母等，其中三孢布拉霉的性能較佳，在生產(chǎn)上也得到較廣泛的使用。
[0004]三孢布拉霉(Blakeslea trispora)屬于毛霉目、弈霉科，是單細胞低等真菌。在一定的培養(yǎng)條件下生長迅速，能在較短的時間內(nèi)達到較大的生物量，適用于規(guī)?；纳a(chǎn)。此外，還有一個特殊之處是三孢布拉霉屬于異宗結(jié)合菌，分為正、負2種，這兩種單性菌株在形態(tài)上沒有明顯的差別，單獨培養(yǎng)能夠進行無性繁殖，當它們混合發(fā)酵時正負菌株的菌絲體互相接觸，發(fā)生異宗配合進行有性繁殖，即可獲得較高產(chǎn)量的胡蘿卜素。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者都在著手探索提高三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的工藝條件，以使其更適合工業(yè)化大生產(chǎn)。由于絲狀真菌三孢布拉霉本身的生長特性，其發(fā)酵培養(yǎng)基多采用粘性較大的物質(zhì)(如淀粉、大豆粉等)來充當碳氮源，以有利于絲狀真菌菌絲的延長，最終形成菌絲球，但粘度較大的發(fā)酵液多數(shù)時間屬于非牛頓性流體，對氧的傳遞有較大的影響;而且在發(fā)酵前期，菌體的快速生長使其對溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)的需求比較高，隨著菌體濃度的增加進一步加大了發(fā)酵液粘度，從而導(dǎo)致溶氧成為限制菌體生長、產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素，甚至引起代謝異常，影響目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。
[0005]因此，在以三孢布拉霉為菌株生產(chǎn)β_胡蘿卜素的發(fā)酵過程中，科研工作者多通過誘變篩選優(yōu)良菌株或改變發(fā)酵的攪拌形式、溶氧供給方式，在發(fā)酵過程中添加氧載體或添加能夠增加菌體細胞通透性的表面活性劑來提高發(fā)酵液中氧濃度及氧的利用率，這些研究對發(fā)酵過程的改善有一定的效果，但也存在著這樣或那樣的不足，或者是最終的產(chǎn)量低，或者是由于設(shè)備復(fù)雜導(dǎo)致成本高，也有的是僅僅針對一個方面而沒有對發(fā)酵過程進行綜合的考慮。我國專利CN1331343A中公開了一種對攪拌槳葉的形式進行改變的工藝，采用上中層為寬葉推進式、下層為渦輪式的組合式攪拌槳葉，提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)性能，不過改變攪拌形式后只能適合該菌株的生產(chǎn)特性，不利于發(fā)酵罐的全面利用；專利CN102787158A中通過對接種前的培養(yǎng)基進行膠體磨高速剪切乳化來提高發(fā)酵液夾帶的氧濃度，該技術(shù)對設(shè)備要求比較高、成本投入較大而且對發(fā)酵的工藝并未進行過多的探索，主要對后續(xù)的提取工藝進行了深入的研究；專利CN1193048A利用氣升式發(fā)酵罐進行三孢布拉霉發(fā)酵制備β-胡蘿卜素，該方法能夠較好的避免剪切力，有利于菌絲的生長從而獲得較大的生物量，但最終的產(chǎn)量較低，也不容易進行規(guī)?；拇笊a(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種利用三孢布拉霉菌制備β-胡蘿卜素的發(fā)酵方法，即通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方和制備工藝，將淀粉進行預(yù)處理獲得粘度適中的發(fā)酵培養(yǎng)基，并結(jié)合菌體本身的生長變化規(guī)律進行補料，從而提高溶解氧濃度并使其得到合理、高效的利用，該方法對提高胡蘿卜素的產(chǎn)量效果顯著。
[0007]本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一種利用三孢布拉霉菌制備β-胡蘿卜素的發(fā)酵方法，其包括如下步驟:(I)菌種活化；(2)—級種子培養(yǎng)；(3)二級種子培養(yǎng)；(4)發(fā)酵培養(yǎng);其中，
[0008](I)菌種活化:在無菌條件下，將三孢布拉霉正、負菌株分別接種到斜面TOA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，26?30°C培養(yǎng)4?5d，待三孢布拉霉正、負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養(yǎng)基中孢子刮洗下來，配制成均勻的孢子懸液，使正、負菌孢子懸液的濃度分別為:正菌14個孢子/mL，負菌15個孢子/mL;其中，三孢布拉霉(Blakeslea trispora)正、負菌株購自ATCC，編號分別為ATCC 14271 ⑴，ATCC 14272(-);
[0009](2)—級種子培養(yǎng):將正、負菌株以孢子懸液的方式分別接入種子罐，正菌株的培養(yǎng)溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為400?600r/min，通氣量為0.6?0.8vvm，罐壓為0.03?0.06MPa，培養(yǎng)時間為20?36h;負菌株的培養(yǎng)溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為500?700r/min，通氣量為0.6?0.8vvm，罐壓為0.03?0.06MPa，培養(yǎng)時間為20?36h，得到三孢布拉霉正、負菌株一級種子液；
[0010](3) 二級種子培養(yǎng):將所述步驟(2)培養(yǎng)得到的所述三孢布拉霉正、負菌株一級種子液混合接種到二級種子罐中，所述三孢布拉霉正菌株一級種子液與所述三孢布拉霉負菌株一級種子液的接種體積比為1:5?1:10，接種量為10?15%，培養(yǎng)時間為10?20h，培養(yǎng)條件為:28°C，轉(zhuǎn)速為600?900r/min，通氣量為0.6?0.8vvm，罐壓為0.03?0.06MPa，得到二級種子液；
[0011](4)發(fā)酵培養(yǎng):采用壓差法將所述二級種子液接入發(fā)酵罐中，接種量為10?15%，在pH 5.5?7.0的條件下培養(yǎng)96?120h，培養(yǎng)條件為:28°C，轉(zhuǎn)速和通氣量隨菌體的生長情況進行控制;發(fā)酵過程需要補入植物油，根據(jù)取樣檢測結(jié)果補入淀粉水解液，根據(jù)菌體的生長情況進行補稀料;其中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:所述淀粉水解液、大豆蛋白粉、魚粉、植物油、硫酸銅、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、Ve、乳化劑。
[0012]具體的，所述步驟(2)每升一級種子培養(yǎng)基中包括如下重量份組分:葡萄糖22?26g，所述大豆蛋白粉26?30g，所述硫酸鎂0.8?1.0g，所述磷酸二氫鉀3?5g，氯化鈣0.06?0.Ig，所述硫酸銅0.06?0.Ig，所述Ve 0.025?0.05g，所述乳化劑0.5?2g;所述步驟(3)每升二級種子培養(yǎng)基中包括如下重量份組分:所述葡萄糖22?26g，所述大豆蛋白粉26?30g，所述硫酸鎂0.8?1.0g，所述磷酸二氫鉀3?5g，所述氯化鈣0.06?0.1g，所述硫酸銅
0.06?0.Ig，所述Ve 0.025?0.05g，所述乳化劑0.5?2g。
[0013]具體的，所述步驟