復(fù)合菌法提取劍麻皂素和/或海柯吉寧的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體設(shè)及提取劍麻皂素和/或?？录獙幍姆椒ā?br>【背景技術(shù)】
[0002] 劍麻，又稱渡蘿麻、西紗爾麻、龍舌蘭麻，是龍舌蘭科龍舌蘭屬植物。據(jù)統(tǒng)計，2010 年末我國劍麻種植面積2.05萬公頃，收獲面積1.83萬公頃，總產(chǎn)纖維4.63萬噸。劍麻中干纖 維重量占全株6%左右，其他90% W上是葉汁、葉渣、麻莖、花軸。目前劍麻最主要的用途是 抽取劍麻纖維，在加工過程中會產(chǎn)生的大量麻渣，成為廢棄物不僅造成資源浪費，而且會造 成環(huán)境污染。為了解決此問題，國內(nèi)的科學(xué)研究者做了大量工作，包括從麻渣中提取劍麻皂 素(又稱替告吉寧，替告皂武元)和?？录獙?又稱?？略砦湓樵硭兀?。
[0003] 劍麻皂素和?？录獙?具體結(jié)構(gòu)分別如下式所示)都含有醬體骨架成分，是半合成 醬體藥物的重要原料。劍麻皂素主要用于合成哺乳動物性信息素雄醬締酬和雄醬締醇，皮 質(zhì)激素氨化可的松、地塞米松及倍他米松，蛋白同化激素、抗屯、律失常藥、抗腫瘤藥環(huán)硫雄 醇，口服避孕藥雙烘失碳醋，骨骼肌松弛藥贓庫漠錠等醬體藥物。
[0004]
[0005] 龍舌蘭屬植物中均含有醬體皂巧元，只是含量多少不同，均可用于提取劍麻皂素 和?？录獙?。中國專利CN1280305C公開了從劍麻或番麻中提取劍麻皂素或番麻皂素，具體 公開了將劍麻或番麻粉碎后加入水和發(fā)酵酶制劑常溫發(fā)酵后，用強酸和有機溶劑或強堿和 有機溶劑水解皂巧，酒精多次重結(jié)晶后得到劍麻皂素或番麻皂素。該方法由于用到了強酸 和強堿，不僅對設(shè)備耐酸堿要求高，而且對環(huán)境有較大污染，另外，還用到了毒性較大的有 機溶劑例如二甲苯等。中國專利申請CN103834713A利用絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)生的粗酶液水解皂 巧，用氯仿或正下醇提取劍麻皂素，該方法雖然提取條件溫和，對環(huán)境污染不大，但因為不 能完全水解皂巧而產(chǎn)生次級巧，導(dǎo)致皂巧降解率低、劍麻皂素回收率低，而且由于?？录獙?只在C-12位比劍麻皂素多了一個酬幾基，在提取得到的劍麻皂素中，不可避免地含有?？?吉寧，因此，不能得到純度較高的劍麻皂素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有的提取劍麻皂素和海柯吉寧的方法所存在的產(chǎn)品收率和純度低，需 要用到強酸、強堿或者有機溶劑不僅污染環(huán)境而且毒性大，工藝復(fù)雜，成本高等問題，本發(fā) 明提供了一種復(fù)合菌法提取劍麻皂素或?？录獙幍姆椒ā?br>[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將不同的霉菌組合，其在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的酶能夠有 效地降解龍舌蘭屬植物麻渣中所含有的醬體皂巧，從而無需使用強酸、強堿或者毒性大的 有機溶劑。本發(fā)明的方法提取條件溫和、成本低廉、對環(huán)境污染小、操作簡單，而且能夠提高 產(chǎn)品收率和純度，從而使麻渣能夠得到充分利用。
[0008] 本發(fā)明具體設(shè)及一種復(fù)合菌法提取劍麻皂素和/或?？录獙幍姆椒ǎㄈ缦虏?驟：
[0009] (1)取龍舌蘭屬植物或其麻渣，加水，調(diào)抑至3-6，加入果膠酶和纖維素酶，攬拌反 應(yīng)后得到清液1;
[0010] (2)將菌種分別接種于培養(yǎng)液中，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與清液1混勻，攬拌反應(yīng)， 靜置，去除上層清液，將下層離屯、，去除上層清液，得到沉淀物1，收集此步驟所得清液高溫 滅菌后棄去；
[0011] (3)將沉淀物1與生石灰混勻，加入75-95%的乙醇水溶液，加熱回流后，加入活性 炭，回流后，離屯、，棄去沉淀，得到清液2;
[0012] (4)在清液2中加入強堿，攬拌溶解后，加入鹽酸徑胺，加熱回流后，離屯、得清液3和 沉淀物2; W及
[0013] (5)將清液3結(jié)晶，干燥得到劍麻皂素;和/或
[0014] (6)將沉淀物2與至少85%的乙醇水溶液和0.5-1.5mol/L的鹽酸水溶液混勻，回流 后，重結(jié)晶，干燥得到?？录獙?。
[0015] 本發(fā)明的方法可W使用各種龍舌蘭屬植物或其麻渣來提取劍麻皂素和?？录獙帲?優(yōu)選劍麻、番麻、亞洲馬蓋麻、假渡蘿麻、無刺番麻，最優(yōu)選劍麻。本發(fā)明所使用的復(fù)合菌優(yōu) 選為黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉（Aspergillus oryzae)，或者為里氏木霉 (Trichorderma reesei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和青霉菌（Penicillium sp.)。
[0016] 本發(fā)明所使用的麻渣可W是龍舌蘭屬植物在抽取纖維后未干燥的麻渣，也可W是 干渣，優(yōu)選干渣。麻渣可W直接使用無需粉碎，也可W在使用前被粉碎。在本發(fā)明中，優(yōu)選龍 舌蘭屬植物或其麻渣被粉碎成粒徑為0. 〇l-5cm的顆粒，更優(yōu)選粒徑為0.1-3畑1，最優(yōu)選粒徑 為約1cm。
[0017] 在步驟（1)中，優(yōu)選加水量為龍舌蘭屬植物或其麻渣重量的0.5-25倍，更優(yōu)選1-10 倍，最優(yōu)選2-5倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，可W使用各種抑調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)抑，包括但不限 于巧樣酸-氨氧化鋼-鹽酸緩沖溶液、憐酸氨二鋼-巧樣酸緩沖液或巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液 等。一般來說，優(yōu)選抑被調(diào)節(jié)至4-5,最優(yōu)選約4.5。優(yōu)選龍舌蘭屬植物或其麻渣:果膠酶:纖 維素酶的重量比為1: (0.001-0.2): (0.0005-0.1)，更優(yōu)選為1: (0.005-0.1): (0.001-0.05)，最優(yōu)選為1:(0.01-0.02) :(0.005-0.01)。優(yōu)選反應(yīng)時間為l-12h，更優(yōu)選為2-化，最 優(yōu)選為4-化。
[0018] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解，各種培養(yǎng)液均可用于本發(fā)明，培養(yǎng)液可W商購得到或 者通過本領(lǐng)域已知的方法自制得到。在本發(fā)明中，黑曲霉或青霉菌的培養(yǎng)液中含有:馬鈴馨 提取液 1.0L、葡萄糖20.0g、K出P〇43.0g、MgS〇4 · 7出0 1.5g、維生素 BiO.lg、瓊脂 15.0g;米曲 霉培養(yǎng)液中含有:麥芽汁1.化、瓊脂15. Og，調(diào)節(jié)抑至4.8;里氏木霉培養(yǎng)液含有:馬鈴馨提取 液1.化、葡萄糖20.Og、瓊脂15.Og。優(yōu)選在上述培養(yǎng)液中，進一步含有質(zhì)量百分比為0.001-0.1 %的麻汁，進一步優(yōu)選麻汁的質(zhì)量百分比為0.005-0.05%，最優(yōu)選為約0.01 %。優(yōu)選在 本發(fā)明中，黑曲霉或青霉菌的培養(yǎng)液組成為：馬鈴馨提取液1.化、葡萄糖20.0g、K出P043 . Og、 1邑5化《7此01.5旨、維生素810.1旨、瓊脂15.0旨、質(zhì)量百分比為0.001-0.1%的麻汁;米曲霉培 養(yǎng)液組成為:麥芽汁1.化、瓊脂15. Og、質(zhì)量百分比為0.001-0.1 % %的麻汁，調(diào)節(jié)抑至4.8; 里氏木霉培養(yǎng)液組成為：馬鈴馨提取液1.0L、葡萄糖20.0 g、瓊脂15. Og、質(zhì)量百分比為 0.001-0.1%的麻汁。在上述培養(yǎng)液中，優(yōu)選麻汁的質(zhì)量百分比為0.005-0.05%，最優(yōu)選為 約 0.01 %。
[0019] 在步驟(2)中，優(yōu)選發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中菌量為2-50mg/mL，進一步優(yōu)選為5-40mg/ mL，更優(yōu)選為10-30mg/mL，進一步更優(yōu)選為12-20mg/mL，最優(yōu)選為約15mg/mL。在使用黑曲霉 和米曲霉的復(fù)合菌方案中，優(yōu)選清液1:黑曲霉發(fā)酵液:米曲霉發(fā)酵液體積比為1:(0.5-5): (0.5-5)，更優(yōu)選為1:(0.8-3) :(0.8-3),最優(yōu)選為1:(1-1.5) :(1-1.5);在使用里氏木霉、米 曲霉和青霉菌的復(fù)合菌方案中，優(yōu)選清液1:里氏木霉發(fā)酵液:米曲霉發(fā)酵液:青霉菌發(fā)酵液 體積比為 1:(0.5-5) :(0.5-5) :(0.1-3),更優(yōu)選為 1:(0.8-3) :(0.8-3) :(0.3-1.5)，最優(yōu)選 為1: (1-1.5): (1-1.5): (0.5-1)。反應(yīng)溫度優(yōu)選為20-60°C，更優(yōu)選為30-40°C，最優(yōu)選為32-37°C。反應(yīng)時間優(yōu)選為0.5-5天，更優(yōu)選為1-3天，最優(yōu)選為約2天。優(yōu)選靜置2-72h，更優(yōu)選 24-60h，最優(yōu)選約48h。優(yōu)選離屯、轉(zhuǎn)速為2000-8000轉(zhuǎn)/min，更優(yōu)選為3000-6000轉(zhuǎn)/min，最優(yōu) 選為 3500-4500轉(zhuǎn)/min。
[0020] 在步驟(3)中，優(yōu)選沉淀物1:生石灰：活性炭：乙醇水溶液的重量比為1:(0.075-0.5) :(0.05-0.3) :(5-15),更優(yōu)選為 1:(0.1-0.3) :(0.075-0.2) :(6-12),最優(yōu)選為 1:0.2: 0.15: (8-10)。優(yōu)選乙醇水溶液的濃度為80-90%，最優(yōu)選為約85%。優(yōu)選加入生石灰后的回 流時間為1-lOh，更優(yōu)選為2-化，最優(yōu)選為約4h;回流溫度為70-90°C，更優(yōu)選為75-85°C，最 優(yōu)選為約79°C。優(yōu)選加入活性炭后的回流時間為0.5-化，更優(yōu)選為1-化，最優(yōu)選為約化。優(yōu) 選離屯、轉(zhuǎn)速為2000-8000轉(zhuǎn)/min，更優(yōu)選為3000-6000轉(zhuǎn)/min，最優(yōu)選為3500-4500轉(zhuǎn)/min。
[0021] 在步驟(4)中，優(yōu)選強堿為氨氧化鋼或氨氧化鐘。優(yōu)選沉淀物1:鹽酸徑胺:強堿的 重量比為 1:(0.1-0.5) :(0.25-1.25)，更優(yōu)選為 1:(0.15-0.3) :(0.3-0.8)，最優(yōu)選為約 1: 0.2:0.5。優(yōu)選回流時間為2-1511，更優(yōu)選為4-10}1，最優(yōu)選為6-化。優(yōu)選回流溫度為70-90°(3， 更優(yōu)選為75-85°C，最優(yōu)選為約79°C。優(yōu)選離屯、轉(zhuǎn)速為2000-8000轉(zhuǎn)/min，更優(yōu)選為3000-6000轉(zhuǎn)/min，最優(yōu)選為 3500-4500轉(zhuǎn)/min。
[0022] 在步驟(6)中，優(yōu)選沉淀物2:乙醇水溶液:鹽酸水溶液的重量比為1:(2-15) :(0.2-5)，更優(yōu)選為1: (3-10): (0.5-2)，最優(yōu)選為1:巧-8): (1-1.6)。優(yōu)選乙醇水溶液的濃度為90-98%，最優(yōu)選為約95%。優(yōu)選鹽酸水溶液的濃度為0.8-1.2111〇1/1，最優(yōu)選為約1111〇1/1。優(yōu)選 回流時間為1 -12h，更優(yōu)選為2-化，最優(yōu)選為4-化。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在步驟(5)和(6)中，可W使用各種本領(lǐng)域已知的結(jié)晶 或重結(jié)晶方法。例如:在步驟(5)中，可W將清液3調(diào)抑至中性，濃縮，冷卻靜置直至劍麻皂素 結(jié)晶不再析出，離屯、，將沉淀用水洗后干燥即得劍麻皂素，其中，優(yōu)選用Imol/L的HC1水溶液 調(diào)抑;在步驟(6)中，將回流后的溶液調(diào)pH至6.5-7.0,蒸饋回收溶劑，將所得固體用熱丙酬 溶解，冷卻靜置直至?？录獙幗Y(jié)晶不再析出，離屯、，將沉淀