一種用于糞便標(biāo)本產(chǎn)單核李斯特菌的選擇培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢驗(yàn)微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于糞便標(biāo)本產(chǎn)單核李斯特菌的 選擇培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物培養(yǎng)是一種用人工方法使微生物生長(zhǎng)繁殖的技術(shù)，而選擇性培養(yǎng)基是用來(lái) 促進(jìn)或抑制一定類(lèi)型的生物體(如細(xì)胞或細(xì)菌等)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，利用運(yùn)種培養(yǎng)基可W將 所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來(lái)。產(chǎn)單核李斯特菌化isteria monocytogenes) 是一種兼性厭氧細(xì)菌，廣泛分布在自然環(huán)境中，如±壤、污水、飼料、動(dòng)物、健康人及各種生 食和即食食品中，包括生肉及熟肉制品、速凍米面食品、奶酪、蔬菜、沙拉和海產(chǎn)品等，可引 起人類(lèi)李斯特菌病，通常是由于人們食用被該菌污染的食物而引起。感染后主要臨床表現(xiàn) 為發(fā)熱、上呼吸道感染、肺炎、腹瀉、血流感染、腦膜炎，或經(jīng)由孕婦陰部感染腹中胎兒、引發(fā) 腦膜炎，甚至死亡。臨床癥狀上與流感相似，容易誤診。
[0003] 近年來(lái)，李斯特菌病已不罕見(jiàn)，在新生兒、妊娠婦女、40歲W上及免疫功能受損的 人群中均可發(fā)生，尤其是妊娠婦女感染李斯特菌的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的30~100倍。早期診斷 并早期治療，可100%治愈。若診斷延誤，病死率可達(dá)20~30%，因此作為確診唯一依據(jù)的臨床 細(xì)菌檢查的正確與快速鑒定極為重要。目前，該菌屬的鑒定金標(biāo)準(zhǔn)為PCR鑒定，但是PCR檢測(cè) 設(shè)備要求和操作成本均較高，因此臨床培養(yǎng)多用膜酪腺大豆瓊脂(TSA-YE)。但是產(chǎn)單核李 斯特菌培養(yǎng)陽(yáng)性率低，主要是臨床培養(yǎng)過(guò)程中該菌容易被認(rèn)為是污染的雜菌(類(lèi)白喉?xiàng)U菌） 而遭丟棄，且糞便標(biāo)本中的大腸桿菌、類(lèi)白喉?xiàng)U菌等在目前的培養(yǎng)基上比產(chǎn)單核李斯特菌 生長(zhǎng)更快，很快覆蓋了培養(yǎng)基，產(chǎn)單核李斯特菌無(wú)法生長(zhǎng)，結(jié)果延誤診療時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對(duì)W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于糞便標(biāo)本產(chǎn)單核 李斯特菌的選擇培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是:一種適合于糞便標(biāo)本產(chǎn)單核李斯特菌的選 擇培養(yǎng)基，其特征為，配制1000ml培養(yǎng)基的配方中含有： 酵母浸出粉5~8g; 牛肉粉6~lOg; 酪蛋白腺6~lOg; 瓊脂15~20g; 葡萄糖3~5g; 氯化鋼5~5.5g; 葡萄糖酸鋒0.01~〇.〇5g; 憐酸二氨鋼1~3g; 光谷甘膚0.1~〇.5g; 多粘菌素0.001~0.005g; 桿菌膚0.001~0.003g; 無(wú)菌馬血蛋白20~50g; 蒸饋水加至1000ml。
[0006] 上述培養(yǎng)基的制備方法為:稱(chēng)取酵母浸出粉、牛肉粉、酪蛋白腺、瓊脂、葡萄糖、氯 化鋼、憐酸二氨鋼，混勻蒸饋水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入;滅菌葡萄糖酸 鋒；滅菌光谷甘膚；滅菌多粘菌素；滅菌桿菌膚；無(wú)菌馬血蛋白混勻，滅菌蒸饋水定容到 1000ml后分裝。
[0007] 其中：所述的牛肉粉、酪蛋白腺、葡萄糖提供碳源、氮源，酵母浸出粉富含蛋白質(zhì)、 氨基酸、多膚、核巧酸、維生素、生長(zhǎng)因子、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，為產(chǎn)單核李斯特菌的繁殖 和生長(zhǎng)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)元素;氯化鋼維持均衡的滲透壓;瓊脂為培養(yǎng)基的凝固劑;葡萄糖酸 鋒為營(yíng)養(yǎng)劑，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入一定濃度的鋒離子，目標(biāo)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)好于對(duì)照 組，因此推論鋒離子有助于該菌的生長(zhǎng);憐酸二氨鋼為緩沖劑，多粘菌素抑制革蘭氏陰性菌 的生長(zhǎng);桿菌膚(Bacitracin),實(shí)驗(yàn)室研究表明桿菌膚可W抑制革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和陰性球菌、 肺炎雙球菌、葡萄球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌等雜菌的生長(zhǎng)，但該濃度下由于對(duì)李斯特菌 屬無(wú)抗菌抑菌作用，因此提高了產(chǎn)單核李斯特菌的分離率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)將同一產(chǎn)單核李斯特 菌接種到2個(gè)TSA-YE培養(yǎng)基上，其中一個(gè)TSA-YE培養(yǎng)基添加0.01%滅菌光谷甘膚于，37°C下 培養(yǎng)，48小時(shí)后觀察菌株，發(fā)現(xiàn)添加光谷甘膚的TSA-YE培養(yǎng)基有小的產(chǎn)單核李斯特菌菌落， 沒(méi)有添加光谷甘膚的TSA-YE培養(yǎng)基未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)單核李斯特菌菌落，光谷甘膚可W降低氧化還 原電勢(shì)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化;無(wú)菌馬血蛋白提供能量環(huán)境；丫-徑基精氨酸為激活劑，可 W促進(jìn)產(chǎn)單核李斯特菌對(duì)礦物質(zhì)的攝取;洋芹素為抑菌劑；山英肉為山榮英科植物山榮英 的果實(shí)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山英肉含山榮英較毛，山榮英裂武，鐵、侶、銅、鋒、棚、憐等21種 元素，蘇氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸等14種氨基酸，維生素 A，葡萄糖、果糖、薦糖、熊果酸、沒(méi)食子 酸、蘋(píng)果酸、酒石酸等糖類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)，山英肉水提液是良好的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，并且對(duì)金黃色 葡萄球菌、奈氏卡他球菌、結(jié)核桿菌、肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒等均有不 同程度的抑菌作用。
[0008] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、產(chǎn)單核李斯特菌分離率高的特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0009] W下結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0010]實(shí)施例1，配制1000ml培養(yǎng)基的配方中含有:酵母浸出粉5g;牛肉粉lOg;酪蛋白腺 6g;瓊脂15g;葡萄糖4g;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼Ig;光谷甘膚0.3g;葡萄糖酸鋒O.Olg;多粘 菌素 O.OOlg;桿菌膚0.003g;無(wú)菌馬血蛋白20g，蒸饋水加至1000ml。制備方法:稱(chēng)取酵母浸 出粉、牛肉粉、酪蛋白腺、瓊脂、葡萄糖、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混勻蒸饋水溶解，210°C，滅菌 15min，冷卻到45°C，加入滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌光谷甘膚;滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;無(wú)菌 馬血蛋白混勻，滅菌蒸饋水定容到1000ml后分裝。
[0011]實(shí)施例2,配制1000ml培養(yǎng)基的配方中含有:酵母浸出粉5g;牛肉粉6g;酪蛋白腺 8g;瓊脂15g;葡萄糖3g;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼3g;光谷甘膚O.lg;葡萄糖酸鋒0.05g;多粘 菌素0.003g;桿菌膚O.OOlg; 丫 -徑基精氨酸0.1 g;無(wú)菌馬血蛋白40g，蒸饋水加至100〇1111。審。 備方法:稱(chēng)取酵母浸出粉、牛肉粉、酪蛋白腺、瓊脂、葡萄糖、氯化鋼、γ-徑基精氨酸、憐酸二 氨鋼，混勻蒸饋水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌光谷甘 膚;滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;無(wú)菌馬血蛋白混勻，滅菌蒸饋水定容到1000ml后分裝。 [00 12]實(shí)施例3,配制1000ml培養(yǎng)基的配方中含有:酵母浸出粉5g;牛肉粉8g;酪蛋白腺 6g;瓊脂18g;葡萄糖5g;氯化鋼5.5g;憐酸二氨鋼2g;光谷甘膚0.5g;葡萄糖酸鋒0.03g;多粘 菌素0.005g;桿菌膚0 . OOlg;洋芹素0.03g;無(wú)菌馬血蛋白50g，蒸饋水加至1000ml。制備方 法:稱(chēng)取酵母浸出粉、牛肉粉、酪蛋白腺、瓊脂、葡萄糖、氯化鋼、憐酸二氨鋼、洋芹素，混勻蒸 饋水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌光谷甘膚;滅菌多粘 菌素;滅菌桿菌膚;無(wú)菌馬血蛋白混勻，滅菌蒸饋水定容到1000ml后分裝。
[001引實(shí)施例4,配制1000ml培養(yǎng)基的配方中含有:酵母浸出粉6g;牛肉粉lOg;酪蛋白腺 8g;瓊脂18g;葡萄糖4g;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼2g;光谷甘膚O.lg;葡萄糖酸鋒0.03g;多粘 菌素0.005g;桿菌膚0.002g;無(wú)菌馬血蛋白30g; 200g化山英肉水提液200ml;蒸饋水加至 1000ml。制備方法：（1)取40g山英肉加水煮沸30min，過(guò)濾，取濾液，根據(jù)濾液體積，采取濃縮 或者加水調(diào)整體積到濃度為200g/L，得山英肉水提液200ml; (2)稱(chēng)取酵母浸出粉、牛肉粉、 酪蛋白腺、瓊脂、葡萄糖、氯化鋼、憐酸二氨