一種用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測 試劑盒，本發(fā)明還涉及一種MMP2基因分型ARMS-qPCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肥胖癥是一種慢性病，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，是人類目前面臨最容易被忽視，但發(fā) 病率卻在急劇上升的一種疾病。肥胖癥能導致多種生理和必理疾病，比如糖尿病、癌癥、必 血管疾病W及社交障礙等。造成肥胖癥的原因很多，比如過量的能量攝入和靜止型的生活 方式等。越來越多的研究表明，遺傳因素在肥胖癥發(fā)病過程中扮演著重要的角色（化ayling et al. 2007, Gerken et al. 2007, Dina et al. 2007, Qiu et al. 2008)。
[0003] MMP2基因位于第16號染色體，編碼一個基質(zhì)金屬蛋白酶，主要功能為剪切細胞外 基質(zhì)。最近，有研究發(fā)現(xiàn)MMP2 rsll32896基因型與女性肥胖癥緊密關(guān)聯(lián)度owan和Boer 2013)。rsll32896CC型相對于rsll32896CT型及TT型具有很高的肥胖癥發(fā)生概率。因此 rsll32896不同的基因型是一個極好的女性肥胖癥風險預(yù)測指標，對于肥胖癥的預(yù)防W及 其后期的治療具有重要的指導意義。
[0004] 可用于MMP2 rsll32896分型的技術(shù)很多，包括如DNA直接測序法、雜交芯片法、焦 磯酸測序法W及變性高效液相色譜法等。其中，DNA測序法為基因分型的金標準，該方法存 在如下缺點；檢測的靈敏度不高，只有大于15%的突變才能檢測到；費時，操作復(fù)雜，對操 作人員要求高；非閉管操作，涉及PCR擴增后的操作，因此易被污染，造成結(jié)果的不理想；通 量太小，一次最多只能做24個，很難大規(guī)模開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對技術(shù)現(xiàn)狀提供一種靈敏度高、特異性強的用于 MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測 方法，該檢測方法靈敏度高、特異性強，而且操作簡單。
[0007] 本發(fā)明解決上述第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為；一種用于MMP2基因分型 的ARMS-qPCR檢測試劑盒，包括qPCR反應(yīng)體系，所述qPCR反應(yīng)體系包括qPCR混合反應(yīng)液、 參照引物、ARMS引物和陽極對照樣品；所述qPCR混合反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、 Tag酶、PCR下游引物和化qMan探針；
[000引所述qPCR反應(yīng)體系中，各組分的終濃度分別為；PCR緩沖液為IX ;dNTP為0. 1~ 1.5mM;MgCl2 為 0. 5 ~5mM;Tag 酶為 0. 05 ~0. lU/μ 1 ;PCR 下游引物為 0. 1~luM;TaqMan 探針為0. 1~1 μ Μ ;參照引物為0. 5 μ Μ ;ARMS引物為0. 5 μ Μ ;陽性對照樣品為1~long/ μ 1。
[0009] 所述PCR下游引物的序列如MMP2-R所示；
[0010] 所述TaqMan探針的序列如MMP2-TaqMan所示；
[0011] 所述參照引物的序列如MMP2-C所示，能夠擴增所有不同MMP2基因型；
[0012] 所述ARMS引物為兩種上游引物中的任意一種，分別對應(yīng)MMP2 CC rsll32896、 TTrsll32896型基因型，送兩種上游引物的序列如MMP2-F1、MMP2-F2所示；送兩種ARMS引 物分別在3'末端與不同的基因型堿基匹配，同時在其3'末端倒數(shù)第2、3位增加一個或者兩 個堿基錯配，W增加其特異性；用于特異性擴增的MMP2 rsll32896位基因型為CC/TT/TC ;
[0013] 所述陽極對照樣品分別為MMP2不同基因型堿基置換的質(zhì)粒基因組DNA。
[0014] 其中，所述 Tag 酶為 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。
[001引各引物序列如下：
[0016] MMP2-R ; 5，-TCTTGGGGACTAGAGTGGAT-3，
[0017] MMP2-TaqMan ; 5' -TGCACTGATACCGGCCGCAG-3'
[0018] MMP2-C ; 5，-TCCAACCTCCCCCTTCCATG-3'
[0019] MMP2-F1 ;5' -TGGTCCGTGTGAAGTATCAC-3'
[0020] MMP2-F2 ;5, -TGGTCCGTGTGAAGTATCAG-3'
[0021] 本發(fā)明解決上述第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為；基于上述試劑盒的MMP2 基因分型ARMS-qPCR檢測方法，該方法先是針對MMP2基因設(shè)計一對參照引物、TaqMan探針， 針對rs 1132896位點的不同基因型設(shè)計ARMS引物，反應(yīng)體系中加入qPCR混合反應(yīng)液，參照 引物或者ARMS引物、TaqMan引物和待測模板DNA進行英光定量PCR的檢測，具體包括如下 步驟：
[0022] (1)設(shè)計并篩選含有MMP2基因 rsll32896位不同基因型通用的參照引物、化qMan 探針及兩種ARMS引物；
[002引 似從細胞體系或血液中提取到基因組DNA作為模板DNA ;
[0024] (3)進行實時英光定量PCR擴增，每個樣本的檢測分3管進行，每個管加入相同的 qPCR混合反應(yīng)液，化qMan探針和模板DNA，每管分別加入?yún)⒄找锖蛢煞NARMS引物中的一 種，進行MMP2基因 rsll32896位基因分型的qPCR檢測；
[0025] (4)結(jié)果判讀：
[0026] 參照引物管擴增曲線陽性，MMP2-F1管擴增曲線陽性，MMP2-F2管擴增曲線陰性或 者其與參照引物管的擴增曲線ΔCT>10，該樣本結(jié)果判定為rsll32896 CC基因型；
[0027] 參照引物管擴增曲線陽性，MMP2-F1管擴增曲線陽性，MMP2-F2管擴增曲線陽性， 該樣本結(jié)果判定為rsll32896 C/T基因型；
[0028] 參照引物管擴增曲線陽性，MMP2-F1管擴增曲線陰性或者其與參照引物管的擴增 曲線ACT> 10，MMP2-F2管擴增曲線陽性，該樣本結(jié)果判定為rsll32896 TT基因型；
[0029] 參照引物管擴增曲線陰性，提示該樣本提取失敗，需要重新進行提取。
[0030] 所述步驟（2)中，模板DNA選自人體血液基因組DNA或者口腔黏膜脫落細胞或頭 發(fā)。
[0031] 所述步驟（3)中，進行PCR擴增反應(yīng)的條件為，95°C預(yù)變性2min，95°C變性15s， 60°C延伸lmin，46個循環(huán)。
[0032] 上述技術(shù)方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time如antitative PCR Detecting System。即實時英光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)，也叫實時定量基因擴增英光檢測 系統(tǒng)，簡稱qPCR。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0034] 本發(fā)明提供了一種MMP2基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒，W解決現(xiàn)有基因分型 檢測技術(shù)中費時、程序繁瑣W及易污染等問題。本試劑盒可W快速、準確、便宜、高通量給 MMP2基因進行分型，其靈敏度高，特異性強，適用于常見樣本比如血液、口腔黏膜W及頭發(fā) 等。
[0035] 本發(fā)明能夠快速、低廉、準確，高通量地檢測檢測人體血液或者其他組織細胞中 MMP2基因不同的類型，對于分型技術(shù)而言，是目前性價比最好的方法，便于臨床或者健康檢 測大規(guī)模的推行。
[0036] 本發(fā)明所用的 ARMS (amplification refractoiT mutation system)即擴增阻礙突 變系統(tǒng)，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設(shè)計兩個5'端引物，一個與正常DM互 補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入送兩種引物及3'端引物進行兩個平行 PCR，只有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3' 端則導致PCR不能延伸，則稱為ARMS。
[0037] ARMS檢測的靈敏度依賴于ARMS引物的特異性W及反應(yīng)條件如反應(yīng)液中MgC12的 濃度，加不加 DMS0等的優(yōu)化。為了增加引物的特異性，減少引物與祀向DNA有錯配時的錯 配延伸，可通過在引物3 '端的第2、3個堿基引入另外一個或者兩個錯配堿基，使之與模板 之間形成多重錯配W阻值錯誤延伸。
[0038] 本發(fā)明所用的探針為5'端FAM標記的化qMan探針，探針兩端分別標記英光報告 基團（時和英光渾滅基團怕)。在探針完整時，即在隨機狀態(tài)和無 PCR產(chǎn)物雜交狀態(tài)時，報 告基團發(fā)出的英光被渾滅基團吸收，檢測不到英光的存在。在ARMS-qPCR擴增過程中，當特 異的PCR產(chǎn)物與化qMan探針發(fā)生雜交反應(yīng)時，Goldstar Best Tag酶的5'端外切酶活性 也把化qMan探針的堿基逐個剪切，報告基團所釋放出的英光就可W被內(nèi)置到PCR儀中的英 光計檢測到。PCR經(jīng)過一個循環(huán)，英光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)擴增的過程， 英光信號的強弱就代表模板DNA拷貝數(shù)的多少。因此本發(fā)明是個很好的基因分型的工具。 [003引綜合了 ARMS引物W及實時英光定量PCR的優(yōu)點，與直接測序等基因分型的技術(shù)相 比較，本發(fā)明用于MMP2基因分型基因檢測具有如下優(yōu)勢：
[0040] 1、特異性強：設(shè)計的ARMS引物分別針對MMP2 TT rsll32896，CCrsll32896的特異 變異序列，能特異地擴增相應(yīng)的基因型DNA ;在ARMS引物3'端的倒數(shù)第2、3個堿基引入另 外一個或者兩個錯配堿基，增加 ARMS引物的特異性；
[0041] 2、本發(fā)明技術(shù)的靈敏度可達1%，遠高于DNA直接測序15%的靈敏度；
[0042] 3、檢測過程為閉管反應(yīng)，大大降低了污染及結(jié)果偏差的可能性；
[0043] 4、操作快速簡單，從樣本送