檢測(cè)桑丁香假單胞菌的引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為一種檢測(cè)桑下香假單胞菌的引物及其應(yīng)用，專用于檢測(cè)桑下香假單胞 菌，屬于農(nóng)作物病害診斷與防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 下香假單胞菌細(xì)菌性病害(Pseudomonas syringae pathovars)是世界上分布最 廣、危害最嚴(yán)重且最難防治的重大細(xì)菌性病害，于2012年被列為十大細(xì)菌性病害之首 (Mansfield, J.et al ,2012,13(6) ,614-629)。此病廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，有 40多個(gè)類型的致病變種，可對(duì)包括草本、灌木和喬本在內(nèi)的200多種植物造成危害 (Rudolph，K.W，1995，1,47-138)。該病害可造成農(nóng)作物最高減產(chǎn)90%，每年在全球范圍內(nèi)造 成直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)350億美元，引起了人們的廣泛關(guān)注。
[0003] 桑疫?。╩ulberry bacterial blight)是由桑下香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv.mori)引起的，桑下香假單胞菌屬于下香假單胞菌的一個(gè)致病變種。桑疫病的 發(fā)生主要是其病原菌通過植株葉片氣孔進(jìn)入植株體內(nèi)，并在植物維管束中進(jìn)行大量繁殖， 導(dǎo)致導(dǎo)管阻塞，植物水分運(yùn)輸受阻，同時(shí)致病菌還不斷合成分泌大量的毒素蛋白破壞植株 組織結(jié)構(gòu)，使得植株最終表現(xiàn)出萎縮及腐爛癥狀，而植株的病變部位主要出現(xiàn)在植株的頂 端或者嫩梢，故桑疫病又稱"爛頭病"。該病因發(fā)病周期短，蔓延態(tài)勢(shì)嚴(yán)峻，已成為制約蠶桑 產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。桑疫病一旦發(fā)生，很難進(jìn)行有效的根治，而處在潛伏期的植物 組織從外觀上很難與正常組織分開，因此，快速有效的早期診斷對(duì)于控制桑疫病的蔓延和 避免重大損失的發(fā)生具有重要意義。
[0004] 快速、精確的早期病原菌檢測(cè)手段是提高病害檢測(cè)效率的基礎(chǔ)，也是降低生物防 治成本的前提。對(duì)于下香假單胞菌的檢測(cè)，目前最主要的有選擇性培養(yǎng)基和分子生物學(xué)的 方法。選擇性培養(yǎng)基最早是由Mohan, S.K.等于1987年報(bào)道利用一種改良的KBC瓊脂培養(yǎng)基 平板法快速檢測(cè)紫下香和菜豆致病變種的下香假單胞菌。GoszczynskaJ.等在前人的基礎(chǔ) 上作出改進(jìn)，于1998年指出利用MT培養(yǎng)基可W進(jìn)行下香假單胞菌與其他病原菌的區(qū)分，從 而達(dá)到檢測(cè)下香假單胞菌的目的。目前使用的分離篩選下香假單胞菌的培養(yǎng)基大多也是基 于W上幾種培養(yǎng)基或改良而來(lái)的。指示植物檢測(cè)法是檢測(cè)病原菌的方法之一，但由于周期 長(zhǎng)，并且受季節(jié)性限制，因此該法不能廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)下香假單胞菌。
[0005] 分子生物學(xué)方法主要包括普通PCR法及巧光定量PCR法。2005年，Zaccardelli，M. 等根據(jù)番茄下香假單胞菌的致病基因 hrpZ為目的片段設(shè)計(jì)特異性引物利用PCR擴(kuò)增對(duì)番茄 下香假單胞菌進(jìn)行快速檢測(cè)。Rees Geo巧e，J.等于2010年依據(jù)16S-23S rDNA序列的間隔區(qū) 設(shè)計(jì)出特異性的引物對(duì)雜猴桃下香假單胞菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。隨著病原菌檢測(cè)手段的不斷提 高，2014年，Gal lei 1 i，A.等在普通PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，利用巧光定量PCR方法 對(duì)雜猴桃下香假單胞菌進(jìn)行快速檢測(cè)。巧光定量PCR方法近年來(lái)憑借其靈敏度高、可靠性 強(qiáng)、穩(wěn)健性好的Ξ大優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食物病原菌及部分植物病原菌的快速檢測(cè)，具有良 好的應(yīng)用前景。然而，截止目前為止，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于應(yīng)用巧光定量PCR方法進(jìn)行桑疫 病病原菌的快速檢測(cè)。
[0006] 因此本發(fā)明嘗試使用巧光定量PCR方法對(duì)桑疫病病原菌進(jìn)行絕對(duì)定量，不但提高 了檢測(cè)的特異性和靈敏度，而且可避免生產(chǎn)上對(duì)桑樹病害的誤判，同時(shí)也降低了病原菌檢 測(cè)所需的時(shí)間，為桑疫病的早期診斷和及早防治打下了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 解決的技術(shù)問題:本發(fā)明通過設(shè)計(jì)用于檢測(cè)桑下香假單胞致病菌的特異性引物而 建立一種靈敏、可靠、穩(wěn)定的檢測(cè)桑下香假單胞菌的引物及其應(yīng)用，從而克服桑疫病病原菌 傳統(tǒng)檢測(cè)方法和半定量PCR檢測(cè)方法的不足。
[000引技術(shù)方案：檢測(cè)桑下香假單胞菌的引物，正義引物Psm240F序列為：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3 '，反義引物Psm4：MR序列為:5 ' -GCTGTTGACCGATGATAT-3 '。
[0009] 所述的引物在巧光定量PCR檢測(cè)中的應(yīng)用，包括W下步驟:1)利用KB液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)病原菌，制備病原菌菌懸液，同時(shí)采用Biospin細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒（Bioer Technology Co.，Ltd.)提取病原菌總DNA，制備菌液和DM標(biāo)準(zhǔn)樣品；2)特異性引物設(shè)計(jì)，對(duì) 致病性的桑下香假單胞菌設(shè)計(jì)了其特異性的引物對(duì)Psm240F/Psm434R，所述引物對(duì)為:正義 引物口3111240尸序列為：5'-4466了44〔6666(：了441'-3'，反義引物口31114341?序列為：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3 ' ； 3)實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)方法反應(yīng)體系為:2化L反應(yīng)體系中，包含 ΙΟμΙ SYBR Premix Ex TaqiHTli R 化 seH Plus)(2X)，0.8yL Psm240F ΙΟμΜ,Ο.如 L Psm434R 10μΜ，0.4化ROX Reference Dye(50X)，2.0化模板為標(biāo)準(zhǔn)病原菌菌懸液和DNA稀 釋液或待測(cè)樣品的菌懸液，6化雙蒸水;4)實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增程序?yàn)?兩步法擴(kuò) 增程序:第一步：95°C預(yù)變性lOmin;第二步:95°C變性15s，60°C延伸31S，反應(yīng)共計(jì)45個(gè)循 環(huán)，PCR完成后，按0.1°C/s升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證;5)取步驟1) 中得到的病原菌菌懸液經(jīng)平板計(jì)數(shù)法定量并進(jìn)行梯度稀釋，稀釋成9個(gè)不同的濃度梯度：1 X l〇8cfu/mL，5 X lO^cfu/mL，1 X l〇7cfu/mL，5 X l〇6cfu/mL，1 X l〇6cfu/mL，1 X l〇5cfu/mL，1 X 104cfu/mL，1 X 103c化/血，1 X 102cfu/mL，同時(shí)，取步驟1)中病原菌的全基因組DNA經(jīng)ND-1000V3.7.1 (Thermo SCIENTIFIC,USA)定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個(gè)不同的濃度梯度： 6. Ong/yL，6.0 X l〇-ingAiL，6.0 X 1〇-2〇邑/化，6.0 X l〇-3ngAiL，6.0 X l〇-4ngAiL，6.0 X 10- 5ngAiL，W不同濃度梯度的菌懸液和DNA為模板按照上述PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò) 增;反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個(gè)濃度梯度的循環(huán)闊值(Ct)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制巧光定量PCR標(biāo)準(zhǔn) 曲線。
[0010] 桑樹桑疫病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)試劑盒，含有上述的引物。
[0011] 桑樹植株帶菌及帶菌量的檢測(cè)試劑盒，含有上述的引物。
[0012]有益效果
[0013]本發(fā)明基于桑下香假單胞菌區(qū)別于其他下香假單胞菌致病變種的特異性致病基 因片段化巧Z gene)設(shè)計(jì)和篩選了一對(duì)特異性引物對(duì)Psm240F/Psm434R，同時(shí)利用該引物對(duì) 建立一種桑疫病病原菌的巧光定量PCR檢測(cè)方法，具有特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，且大大 縮短了檢測(cè)所需時(shí)間，從樣品處理至得出結(jié)果只需4~化。因此該方法適用于桑疫病的早期 診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是引物對(duì)Psm240F/Psm434R特異性檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道1為陰性對(duì)照； 泳道2、3模板為桑下香假單胞菌Psml4-7 (保藏編號(hào)為:CGMCC NO. 11139)和M4-13 (保藏編號(hào) 為CGMCC NO. 3621)的全基因組DNA;泳道4、5、6模板為紫下香假單胞菌（ICMP3189)、紫下香 假單胞菌(BCCM-LMG5083)、番茄DC3000下香假單胞菌(ATCC10862)的全基因組DNA;泳道Τι? 的模板分別為惡臭假單胞菌 (PSY12-1)、食樹脂假單胞菌 (PS-N)、替實(shí)假單胞菌 (R-PS-2)、黃毛格假單胞菌(PS-K)、巧光假單胞菌(A.S.31)、魔氏假單胞菌(BQM5)、蒙氏假單胞菌 (LY107)、變形假單胞菌(PS-L)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(PS-E)、大腸桿菌化Η5α)、洋蔥伯克霍爾 德氏（ATCC 25416)的全基因組DNA;M為lOObp DNA Ladder;
[0015] 圖2-1是普通PCR靈敏性擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道1-9的模板為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中 菌液的濃度分別為：1 X l〇8cfu/mL，5 X l〇7cfu/mL，1 X l〇7cfu/mL，5 X l〇6cfu/mL，1 X l〇6cfu/ mL，1 X l〇5c化/mL，1 X l〇4cfu/mL，1 X l〇3c化/mL，1 X l〇2cfu/mL 10為空白對(duì)照；11為陰性對(duì) 照;Μ為lOObp DNA Ladder;
[0016] 圖2-2是普通PCR靈敏性擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道2-7的模板為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中 DNA濃度分別為：6. Ong/yL，6.0 X lO-ing/yL，6.0 X l〇-2ngAiL，6.0 X l〇-3ngAiL，6.0 X l〇-4ng/ yL，6.0X l〇-5ng/化；1 為空白對(duì)照;M為lOObp DNA Ladder;
[0017] 圖3是實(shí)施例1巧光定量PCR引物特異性擴(kuò)增溶解曲線，縱軸為Derivative;橫軸為 Temperature,反應(yīng)體系中菌液濃度分別為 1 X 108cfu/mL，5 X 107cfu/mL，1 X 107cfu/mL，5 X l〇6cfu/mL，1 X l〇6cfu/血，1 X l〇5cfu/mL，1 X l〇4cfu/mL，1 X 1〇3?；?血，1 X l〇2cfu/mL，特異 性產(chǎn)物的化值為86.7°C。
[001引圖4a W CT值為縱坐標(biāo)，DNA濃度的Log值為橫坐標(biāo)繪制的巧光絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖：DNA濃度在6.0-6.0X10-5ng/化范圍內(nèi)，其Log值與Ct值呈良好的線性關(guān)系，y = -2.79612X+15.27236，r2 = 0.96606。
[0019] 圖4b WCT值為縱坐標(biāo)，菌液濃度的Log值為橫坐標(biāo)繪制的巧光絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖：菌液濃度在102-10 8cfu/mL范圍內(nèi)，其Log值與Ct值呈良好的線性關(guān)系，y = -4.56215x+ 46.91167,R^ = 0.98872ο
[0020] 圖5是實(shí)施例2田間爆發(fā)桑疫病桑樹發(fā)病葉片中的病原菌和陽(yáng)性對(duì)照菌株巧光定 量PCR擴(kuò)增的溶解曲線，縱軸為導(dǎo)數(shù)（Derivative);橫軸為溫度（Temperature),引物為 Psm240F/Psm434R，特異性產(chǎn)物的 Tm 值為 86.7°C。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1桑下香假單胞菌的特異性引物檢測(cè)
[0022] (1)參試菌株的培養(yǎng)和DNA提取
[0023] 參試的18株菌株包括2株分離于桑疫病爆發(fā)的桑園的桑下香假單胞菌Psml4-7(保 藏編號(hào)為:CGMCC No. 11139)和M4-13(保藏編號(hào)為CGMCC No.3621),3株其他致病變種的下 香假單胞菌包括紫下香假單胞菌（ICMP3189)、紫下香假單胞菌（BCCM-LMG5083)、番茄 DC3000下香假單胞菌(ATCC10862)，其他13株非下香假單胞菌屬的菌株包括惡臭假單胞菌 (PSY12-1)、食樹脂假單胞菌(PS-N)、替實(shí)假單胞菌(R-PS-2)、黃毛格假單胞菌(PS-K)、巧光 假單胞菌(A. S. 31)、魔氏假單胞菌(BQM5)、蒙氏假單胞菌化Y107)、變形假單胞菌(PS-L)、嗜 麥芽寡養(yǎng)單胞菌(PS-E)、大腸桿菌(DH5a)、洋蔥伯克霍爾德氏(ATCC 25416)、桑青枯菌(RS-5)、桑腸桿菌(LGD8)。將菌株接種到邸液體培養(yǎng)基中（膜蛋白腺20g，屯水合硫酸儀1.5g，Ξ 水合憐酸氨二鐘1.5g，甘油lOmL，蒸饋水10001^，9^.2±0.2)，28°(3，在轉(zhuǎn)速為200巧111的恒 溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，使用Biospin Genomic DNA Extraction Kit提取參試菌株的全 基因組DM。
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