轉(zhuǎn)基因植物中cry35Ab基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中cry35Ab基因的引物組、試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2014年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積高達(dá)1.815億公頃，比1996年商業(yè)化初期增長了100余倍。目前商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性狀為抗蟲和抗除草劑。來源于蘇云金芽孢桿菌(BaciIIus thuringiensis，Bt)的抗蟲基因是目前在轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用最廣的抗蟲基因，包括crylAb、crylF、crylIe、crylC、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等，其中cry35Ab基因已廣泛應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因玉米新品種研究中，含有cry35Ab基因的轉(zhuǎn)基因玉米已獲準(zhǔn)進(jìn)口我國用作加工原料。針對cry35Ab基因開展快速精準(zhǔn)的檢測方法研究，是轉(zhuǎn)基因生物安全管理相關(guān)法律法規(guī)順利實施的技術(shù)支撐和保障。
[0003]轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)主要分為兩大類:一類以外源DNA為檢測對象，如PCR、基因芯片等，另一類以外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)為檢測對象，如ELISA、免疫試紙條等。在上述方法中，目前PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，但基于PCR的轉(zhuǎn)基因檢測方法需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)儀器設(shè)備，且擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測時間較長(約3?4 h)，難以達(dá)到現(xiàn)場快速檢測目的，因此，在實際工作中需要一種更加便捷、準(zhǔn)確、且適用于現(xiàn)場操作的轉(zhuǎn)基因檢測新技術(shù)。
[0004]LAMP技術(shù)是由日本榮研化學(xué)株式會社在2000年開發(fā)的一種新的基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的基本特點是:①恒溫擴(kuò)增:整個擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫條件(60?65°C)進(jìn)行，不需要特殊儀器設(shè)備;②快速尚效:整個擴(kuò)增和廣物檢測可在I h內(nèi)完成;③尚特異性:針對革El標(biāo)序列的6個區(qū)域設(shè)計4條檢測引物，擴(kuò)增特異性高;④高靈敏度:檢測極限可低至10個拷貝或更低;⑤鑒定簡便:可通過肉眼或濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)的沉淀變化，或在反應(yīng)管中加入染色劑后通過肉眼觀察顏色變化等方法，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行便捷的檢測。
[0005]LAMP方法具有快速高效、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，不需要特殊儀器，適合現(xiàn)場快速檢測，在轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚未有利用LAMP方法檢測轉(zhuǎn)基因植物中cry 35Ab基因的檢測方法和試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的在于公開一種轉(zhuǎn)基因植物中cry35Ab基因的LAMP檢測引物組。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于公開一種轉(zhuǎn)基因植物中cry35Ab基因的LAMP檢測試劑合
ΙΤΓΤ.0
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于公開一種基于上述引物組和試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因植物中cry35Ab基因的LAMP檢測方法。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下: 根據(jù)cry35Ab基因的核苷酸序列，設(shè)計cry35Ab基因的LAMP檢測引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1?6;確定LAMP檢測方法的技術(shù)參數(shù)，并對檢測方法的特異性進(jìn)行驗證。
[0010]轉(zhuǎn)基因植物中cry35Ab基因的LAMP檢測引物組，包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物F3:CACCGACGAGTCCTCCAA(SEQ ID NO:1);
外引物B3:ACGGGGTGGTCTTGATCTG(SEQ ID NO:2);
內(nèi)引物FIP:CGATGATCGGCTTCTGCGGGCAACCCGAACCAGCAATGG(SEQ ID N0:3)；
內(nèi)引物BIP:GACCGGCAACATCGACAACGGGGTCGTTCACCATGATGCASEQ ID NO:4);
環(huán)引物L(fēng)F:TGCACGGACGTCAGGTT(SEQ ID NO:5);
環(huán)引物L(fēng)B:GCAGCTCATGGGCTGGA(SEQ ID N0:6)。
[0011]轉(zhuǎn)基因植物中cry 35Ab基因的LAMP檢測試劑盒，包括以下組分:
(1)檢測引物溶液:由上述6條引物配制的檢測引物溶液，外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B的濃度依次為4?6 ymol/L、4?6 ymol/L、32?48 pmol/L、32?48 ymol/L、4?6 ymol/L和4?6 pmol/L；
(2)具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶:濃度為7?9 U/yL；
(3)10X反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCKpH 8.8,100 mmol/L KCl，100 mmol/L(NH4)2S04，40?100 mmol/L MgS〇4，6?14 mol/L甜菜喊；
(4)dNTPs溶液，由濃度分別為10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(5)顯色劑:1000XSYBRGREEN I熒光染料。
[0012]優(yōu)選的，所述的檢測引物溶液中含有5ymol/L外引物F3、5 ymol/L外引物Β3、40 μmol/L內(nèi)引物FIP、40 ymol/L內(nèi)引物BIP、5 ymol/L環(huán)引物L(fēng)F、5 ymol/L環(huán)引物L(fēng)B。
[0013]優(yōu)選的，所述的Bst DNA聚合酶的濃度為8 U/yL。
[0014]優(yōu)選的，所述的10X反應(yīng)緩沖液中MgS04、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L和8mol/L。
[0015]利用以上所述的試劑盒檢測cry35Ab基因的方法，包括如下步驟:
(1)提取待測樣品的基因組DNA；
(2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200yL PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2-5 yL、檢測引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I yL、10 X反應(yīng)緩沖液2.5 yL、dNTPs溶液2~5 yL，用滅菌去離子水或超純水補齊至總體積為25 yL；
(3)在反應(yīng)管蓋上加IyL的顯色劑，蓋到反應(yīng)管上；
(4)運行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):將反應(yīng)管放置在恒溫水浴鍋中，65°C孵育60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:顛倒反應(yīng)管，使管蓋上的顯色劑與反應(yīng)溶液充分混合，若反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色則為陽性，若顯現(xiàn)橙色則為陰性。
[0016]通過實驗證明，本發(fā)明提供的cry35Ab基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0017]圖1是實施例2中進(jìn)行特異性檢測的結(jié)果圖，卜8依次為轉(zhuǎn)cryI Ie基因玉米IE09S034、轉(zhuǎn)(^710基因水稻11(3-19、轉(zhuǎn)(^71?基因玉米1(]1507、轉(zhuǎn)(^734六13和(^735六13基因玉米59122、轉(zhuǎn)vip3A基因MIR162、轉(zhuǎn)dmo基因大豆M0N87708、轉(zhuǎn)aadl基因玉米DAS40278-9和非轉(zhuǎn)基因玉米對照。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0019]實施例1試劑盒及其檢測方法。
[0020]按下列配方制備cry35Ab基因的LAMP檢測試劑盒，每個試劑盒的規(guī)格為100次反應(yīng):
(1)檢測引物溶液:合成外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B，將引物干粉用超純水分別配成濃度為100 wnol/L的母液，然后分別取5 yL外引物F3、5 yL外引物B3、40 yL內(nèi)引物FIP、40 yL內(nèi)引物BIP、5 yL環(huán)引物L(fēng)F、5 yL環(huán)引物L(fēng)B，放入一個新的1.5 mL離心管中，充分混勻，配成100 yL的cry35Ab基因的LAMP檢測引物溶液，其中引物序列分別為:
外引物F3:CACCGACGAGTCCTCCAA(SEQ ID NO:1);
外引物B3:ACGGGGTGGTCTTGATCTG(SEQ ID NO:2);
內(nèi)引物FIP:CGATGATCGGCTTCTGCGGGCAACCCGAACCAGCAATGG(SEQ ID N0:3)；
內(nèi)引物BIP:GACCGGCAACATCGACAACGGGGTCGTTCACCATGATGCAS