一種檢測(cè)adh1b基因*2多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測(cè)ADH1B基因巧多態(tài)性的引物與 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙醇脫氨酶(ADH1B基因編碼)是酒精代謝的關(guān)鍵酶之一，其突變可影響酒精代謝 進(jìn)而引起乙醒等有害物質(zhì)的堆積，影響身體健康。研究表明，ADH1B基因位點(diǎn)存在3個(gè)等位基 因，分別編碼3個(gè)亞基，即01(4畑1帖1)，的(4面1帖2)和盼(4〇化8*3)。4畑1帖2等位基因編碼 的的多膚組成的乙醇脫氨酶具有高活性。ADH1B基因*2多態(tài)性(NM_000668.5 : C . 143A〉G， p.His48Arg)可導(dǎo)致乙醇脫氨酶活性極大增強(qiáng)，乙醇代謝至乙醒的速度較快，促進(jìn)了體內(nèi)乙 醒的堆積。因此，ADH1B基因巧基因多態(tài)性可導(dǎo)致飲酒后體內(nèi)乙醒堆積，當(dāng)血液中乙醒達(dá)到 一定濃度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)面紅、頭痛、屯、動(dòng)過(guò)速、呼吸苦難等不適，表現(xiàn)為對(duì)酒精的不耐受性，稱 為面紅反應(yīng)。帶有ADH1B*2等位基因的個(gè)體飲酒后比帶有ADH1B*1等位基因的個(gè)體有更不愉 快的反應(yīng)，因此，他們具有更低的飲酒頻率。同時(shí)，有研究表明ADH1B巧等位基因是A畑1B和 A畑1C基因多態(tài)性中負(fù)責(zé)酒精中毒易感性的位點(diǎn)。
[0003] 檢測(cè)A畑1B基因巧多態(tài)性對(duì)指導(dǎo)人們健康飲酒和降低酒精中毒的發(fā)生具有重要的 意義。中國(guó)專利申請(qǐng)201510085568.2公開(kāi)了一種檢測(cè)ADH1B基因的單一核巧多型性R49H的 基因型和ALD肥基因的單一核巧多型性E487K的基因型的引物組和定序引物，但其用于檢測(cè) ALDH2基因*2和ADH1B基因巧多態(tài)性準(zhǔn)確度不足?，F(xiàn)有技術(shù)缺少一種檢測(cè)特異性和靈敏度 高、準(zhǔn)確性和精密性好的A畑1B基因巧多態(tài)性檢測(cè)引物及其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)ADH1B基因巧多態(tài)性的引物 與方法，具有檢測(cè)特異性和靈敏度高，準(zhǔn)確性和精密性好等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了ADH1B基因巧多態(tài) 性的檢 ii。本發(fā)明檢測(cè)的位點(diǎn)為 ADH1B 基因 *2(NM_000668.5:c. 143A〉G，p.His48Arg， rsl229984)。
[000引本發(fā)明提供一種檢測(cè)ADHIB基因*2多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物;所述PCR擴(kuò)增引物為上游引物5'- CAACACTCTCCACGATGC-3'（SEQ ID N0.1)和下游 引物5'-TGAACAGCTTCTCTTTATTCT-3'（SEQIDN0.2);所述SNaPshotPCR引物為5'-TTTTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC-3 '（沈Q ID NO.3)。
[0006] 采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的檢測(cè)ADH1B基因*2多態(tài)性的引物，可W實(shí)現(xiàn) A畑1B基因巧多態(tài)性的特異性檢測(cè)，準(zhǔn)確性好。
[0007] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)A畑1B基因巧多態(tài)性的方法，包括如下步驟： 51、 提取DNA樣品； 52、 W步驟S1所述的DNA樣本為模板，利用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，； 53、 W步驟S2所述的純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用權(quán)利要求1中所述的挪aPshot PCR引物進(jìn)行SNaPshot PCR擴(kuò)增，并對(duì)SNaPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； 54、 采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)步驟S3所述的純化后的挪aPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)， 并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[000引優(yōu)選地，所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟S2中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:98°C預(yù)變性3min，98°C變性 10s，58°C退火30s，72°C延伸Imin，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min，結(jié)束后25°C保溫。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟S3中的挪aPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:96°C變性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，結(jié)束后4°C保溫。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟S4中，采用GE肥MAP陽(yáng)RID V4.1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[001引此外，本發(fā)明還提供檢測(cè)A畑1B基因巧多態(tài)性的引物在制備檢測(cè)A畑1B基因巧多態(tài) 性試劑中的用途。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種檢測(cè)A的ΠΒ基因巧多態(tài) 性的引物，該引物的特異性和準(zhǔn)確性好，可用于實(shí)現(xiàn)ADH1B基因巧多態(tài)性的檢測(cè)，檢測(cè)效率 高。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)ADH1B基因巧多態(tài)性的測(cè)aPshot法，通過(guò)使用特異性的 PCR擴(kuò)增引物和S化Pshot PCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性和精密性好等優(yōu)點(diǎn)，檢 測(cè)結(jié)果可用于指導(dǎo)人們健康飲酒和降低酒精中毒的發(fā)生。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1本發(fā)明提供的A畑1B基因*巧I物的部分?jǐn)U增片段。
[001引圖2本發(fā)明提供的A畑1B基因*巧I物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
[0016]圖3樣品的A畑1B基因巧多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)化圍。
[0018] 實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)ADH1B基因巧的基因多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反應(yīng)條件的優(yōu) 化和比較，篩選出了特異性好的引物。本發(fā)明提供的引物如表1所示。本發(fā)明提供的所有引 物序列均通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，無(wú)已知SNP位點(diǎn)。
[0019] 實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的A畑1B基因巧引物于UCSC中進(jìn)行Blasting,結(jié)果如下：ΑΜΠΒ基因巧擴(kuò) 增片段位于C虹4:100239170+100239459,長(zhǎng)度為290bpDADHlB基因巧特異引物的擴(kuò)增片段 及基因組位置如圖1所示，引物的擴(kuò)增片段覆蓋了相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)ADH1B基因*2,無(wú)其它同 源基因。
[0020] 使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對(duì)檢測(cè)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，部分測(cè)序結(jié) 果如圖2所示。測(cè)序結(jié)果顯示，引物擴(kuò)增片段與A畑1B基因巧基因參考序列吻合。A畑1B基因* 2基因參考序列號(hào)為ADH1B NC_000004.12，NM_000668.5。
[0021 ] 使用表1中測(cè)aPshot PCR引物，S化Pshot法進(jìn)行檢測(cè)，部分結(jié)果如圖3所示。從圖3 可知，產(chǎn)物峰的相對(duì)位置及測(cè)序反應(yīng)滲入的堿基與預(yù)期相符，且無(wú)其它干擾峰。
[0022] 實(shí)施例Ξ A畑1B基因巧多態(tài)性的檢測(cè) 1、提取抓TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANamp Blood DNA Kit(購(gòu)自 Τ iagen，貨號(hào)DP318 )的說(shuō)明書(shū)，將DNA樣品稀釋至1 OOngAiL，備用。
[0023] 2、多重PCR擴(kuò)增 (l)PCR擴(kuò)