檢測fix基因全外顯子的方法和引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及檢測FIX基因全外顯子突變的引物 和方法
【背景技術(shù)】
[0002] 血友病B也稱為凝血因子IX(FIX)缺乏癥，是一種X染色體連鎖隱性遺傳病，發(fā)病機 制為FIX(F9)基因突變導致血漿中FIX含量減少或功能缺陷，在男性中的發(fā)病率為1/30000， 在女性中罕見。血友病B癥狀主要表現(xiàn)為患者全身各部位自發(fā)性或損傷后過度出血，目前尚 無有效的治愈方法，只能通過輸血或FIX濃縮制劑來減輕或延緩癥狀，因而給患者家庭和社 會帶來沉重的負擔。
[0003] FIX基因位于Xq26.3-27.2，全長34化，由8個外顯子、7個內(nèi)含子W及側(cè)翼順序中的 調(diào)區(qū)域構(gòu)成。8個外顯子長度從25bp至1935bp不等，外顯子1編碼信號膚，可引導合成的蛋白 分泌至血液中；外顯子巧日3編碼前膚和化A結(jié)構(gòu)域;外顯子4編碼類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域I， 該結(jié)構(gòu)域可與Cah緊密結(jié)合;外顯子5編碼類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域II;外顯子6編碼活化結(jié)構(gòu) 域，凝血過程中在XIa、Wa和組織因子的共同作用下FIX將在第221位組氨酸、第269位精氨 酸和第365位絲氨酸處被切斷，形成輕鏈和重鏈，此時FIX就轉(zhuǎn)變成了有活性的FIXa;外顯子 7和8編碼催化結(jié)構(gòu)域，在催化FX向FXa的轉(zhuǎn)化中起著十分重要的作用。FIX基因缺陷類型十 分繁多，最新的人類基因突變數(shù)據(jù)庫中收集到的突變FIX基因突變已超過1000個，包括點突 變、小片段的插入和缺失、大片段的復制重排等多種突變類型，其中最常見的是由單個堿基 突變所造成的錯義突變、無義突變和剪接突變。
[0004] 基因測序技術(shù)尚未普及之前，家系連鎖分析是最常用于血友病家族女性攜帶者檢 測及產(chǎn)前基因診斷的方法。由于連鎖分析需提供家系中多名成員的血樣，盡可能使家系的 遺傳信息完整，且必須檢測到具有多態(tài)性意義的標志性位點時才能采用，因而在實際使用 時可能面臨諸多的限制。當采用的多態(tài)性位點位于基因外時，也可能由于同源重組現(xiàn)象而 使得連鎖分析出現(xiàn)錯誤，導致最終的結(jié)果判定產(chǎn)生較大的誤差。直接突變檢測通過DNA測序 儀對F9基因直接測序，找出突變的確切位置，可提供更為準確的信息。由于實現(xiàn)了自動化操 作，我們采用的PCR結(jié)合DNA直接測序方法，因而大大縮短了診斷時間，節(jié)省了的人力和物 力，測序效率高，能夠確定基因突變的位置和形式，結(jié)果也更為明確。
[0005] 多種基因突變檢測技術(shù)包括蛋白截斷試驗(PTT)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、異源雙 鏈分析化A)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)等方法，但所有運些方 法均有一定的局限性，從而限制了基因突變的檢出率。目前常用的基因突變檢測的方法是 基因測序和巧光定量PCR等。由于FIX容量大、突變類型多、突變率高、突變位點散在分布，故 而阻止了對FIX基因突變的深入研究，巧光定量PCR法并不適用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供檢測FIX基因全外顯子的引物，采用Sanger測序法，可用于快速檢測 FIX基因全外顯子突變的情況，用于皿的基因診斷。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供檢測FIX基因全外顯子的引物，包括:擴增覆蓋檢測FIX基 因全外顯子突變的7對正、反向引物;其堿基序列為：
[000引 門X-1-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT
[0009] FIX-1-R:AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT
[0010] 門 X-2"-F: TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG
[0011] FIX-2+3-R：AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC
[0012] 巧X-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT
[0013] FIX-4R：AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC
[0014] FIX-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA [001 引 門X-5R:AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA
[0016] 門X-6F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG
[0017] FIX-6R：AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA [001 引 門X-7F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA
[0019] FIX-7R：AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT
[0020] 門X-8F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG
[0021] 門X-8R:AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA
[0022] 進一步地，所述7對正、反向引物的使用濃度比為：FIX-1F:FIX-1R=1:1;FIX-化 3F:FIX-2+3R=l: 1 ;FIX-4F:FIX-4R=1:1 ;FIX-5F:FIX-5R=1:1 ;FIX-6F:FIX-6R=1:1; FIX-7F:FIX-7R=1:1 ；FIX-8F:FIX-8R=1:1 〇
[0023] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測FIX基因全外顯子的方法，其包括如下步驟：
[0024] (1)提取樣品 DNA;
[00 巧](2)利用 7 對擴增引物 FIX-1F 與 FIX-lR;FIX-2+3F 與 FIX-2+3R;FIX-4F 與 FIX-4R; FIX-5F 與 FIX-5R; FIX-6F 與 FIX-6R; FIX-7F 與 FIX-7R; FIX-8F 與 FIX-8R對（1)中的DNA 進行擴 增，獲得覆蓋檢測FIX基因全外顯子序列的擴增產(chǎn)物；
[0026] (3)利用1對測序引物M13-F與M13-R對(2)中的擴增產(chǎn)物進行正向和反向測序，獲 得所述擴增產(chǎn)物的基因序列；
[0027] (4)將(3)中的基因序列與野生型FIX基因序列進行比較，確定突變位點是否存在； 其中所述引物序列為：
[0028] FIX-1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT
[0029] FIX-1-R：AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT
[0030] 門 X-2"-F: TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG
[0031] FIX-化3-R:AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC [003。門X-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT
[0033] FIX-4R：AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC
[0034] 門X-5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA
[003引 門X-5R:AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA
[00；36]門 X-6F: TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG
[0037] FIX-6R：AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA
[0038] 門X-7F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGCACCTAGAAGCCAATA
[0039] FIX-7R：AACAGCTATGACCATGCCCTTCTGCCTTTAGCCCAAT
[0040] 門X-8F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAACATAATATTGAGGAGACAG [0041 ]門X-8R:AACAGCTATGACCATGTTAGTTAGTGAGAGGCCCTGTTAA
[0042] Ml3-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0043] Ml3-R：AACAGCTATGACCATG
[0044] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測FIX基因全外顯子的試劑盒，所述試劑盒包括 樣品DNA抽提試劑;無水乙醇;檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照 品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應液包括7對擴增引物FIX-1F與FIX-1R;FIX-化3F與 FIX-2+3R;FIX-4F與FIX-4R;FIX-5F與FIX-5R;FIX-6F與FIX-6R;FIX-7F與FIX-7R;FIX-8F與 FIX-8R，測序體系包括1對測序引物Ml 3-F與Ml 3-R，包括：
[0045] 門X-1-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTACAACTAATCGACCTTACCACTT
[0046] FIX-1-R：AACAGCTATGACCATGCGTGCTGGCTGTTAGACTCT
[0047] 門 X-2"-F: TGTAAAACGACGGCCAGTCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAG
[0048] FIX-2+3-R：AACAGCTATGACCATGGAATTGCTTACCAACATACTGCTTC
[0049] 門X-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCTTCCAGGTCAGTAGTT
[0050] FIX-4R：AACAGCTATGACCATGAGGTGAGTCGGAACATCATTATTAC [0化 1 ]門X-5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACTCTTATTTCAAGGCTCCAA [005。門X-5R:AACAGCTATGACCATGAAGGAAGCAGATTCAAGTAGGA [0化；3]門 X-6F: TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTCTATTCACTGATTAG [0054] FIX-6R：AACAGCTATGACCATGCATCCCAATAGGTCTGTCTAGTA [005引