一種prrsv、pcv2、prv和csfv的多重pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種PRRSV、PCV2、PRV和 CSFV的多重PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syn化ome virus，PRRSV)引起的一種W豬繁殖障礙和呼吸道系統(tǒng)疾病為主要癥狀的傳染病。圓環(huán)病毒 相關(guān)疾?。╬orcine circovirus associated diseases，PCVAD)是由圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2)引起的一系列相關(guān)的臨床疾病，其中包括仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合 征（Postweaning multisystemic wasting synd;rome，PMWS)，豬皮炎與腎病綜合征 (Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)和豬呼吸道疾病綜合征 (化rcinerespiratoiT disease syn化ome，PRDS)等。其中PMWS最為嚴(yán)重，可引起斷奶仔豬 漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難、腹瀉、貧血等癥狀。豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒 (Pseudorabies vi;rus，PRV)引起的一種W發(fā)熱、奇癢、急性腦脊髓炎等典型神經(jīng)癥狀并具 有致死性的急性傳染病，感染豬后可引起仔豬發(fā)病死亡，懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎 等癥狀。豬攝（Classical swine fever,CSF)是由豬攝病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種W急性出血和發(fā)熱為主要特征的傳染病。近年來，PRRS、PCVAD、PR 和CSF已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 由于運(yùn)幾種疾病在臨床上往往呈現(xiàn)相似的癥狀，又常常發(fā)生混合感染，且根據(jù)臨 床癥狀較難進(jìn)行鑒別診斷，常規(guī)的血清學(xué)診斷方法又存在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)料、敏感性 和特異性低等不足，與傳統(tǒng)方法相比，PCR方法具有快速、敏感和易于操作的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng) 用于畜禽傳染病檢測和鑒別診斷中，有很多學(xué)者針對運(yùn)四種病原建立了該病原的PCR診斷 方法，但是在感染多種病原時(shí)，不同的體系和程序使得單重PCR方法操作步驟多且實(shí)際用量 大。多重RT-PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種PCR擴(kuò)增技術(shù)。其基本原理是在 一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對引物，如果存在與各對引物特異互補(bǔ)的模板，在同一反應(yīng)體 系中可同時(shí)擴(kuò)增出多條目的DNA片段。多重RT-PCR既有單個(gè)PCR的特異性和敏感性，又較之 快捷、經(jīng)濟(jì)，一次PCR反應(yīng)，可同時(shí)檢測多種病原。該方法可快速檢測鑒別多種病原體，在臨 床多種病原體混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特優(yōu)勢和很高的實(shí)用價(jià)值。為此，開展了多重 PCR技術(shù)檢測運(yùn)4種病的研究，建立同時(shí)快速鑒別診斷運(yùn)4種病毒的方法，并應(yīng)用于臨床實(shí)踐 中，W期為運(yùn)些疾病的防制和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán) 病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬攝病毒多重PCR檢測試劑盒及其檢驗(yàn)方法，該試劑盒能夠快速、 特異的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬攝病毒。
[0005] 本發(fā)明具體通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 一種PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄體系、2 X NanoPCR Mix和引物組合物，其中所述的引物組合物為：
[0007] PRRSV的上游引物沈Q ID N0.1和下游引物沈Q ID N0.2;
[000引 CSFV的上游引物沈Q ID NO.3和下游引物沈Q ID NO.4;
[0009] PCV2的上游引物沈Q ID NO.5和下游引物沈Q ID NO.6;
[0010]?3乂的上游引物569 10^).7和下游引物569 10^).8。
[0011]所述的反轉(zhuǎn)錄體系為5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和 反轉(zhuǎn)錄引物，所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，所述的反轉(zhuǎn)錄引物為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.4。
[001。所述的2XPCR Mix由DNA聚合酶、2XPCR buffer和dNTP Mixture組成。
[0013] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的多重PCR試劑盒還包括RNA提取試劑:TRIzol LS Reagent、 氯仿、異丙醇、75 %乙醇。
[0014] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬 偽狂犬病毒和豬攝病毒陽性對照。
[0015] 其中，陽性對照可為將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種Marc-145細(xì)胞后，收集72~ 96小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物;將豬圓環(huán)病毒2型與豬偽狂犬病毒接種PK-15細(xì)胞后，收集72~96小時(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)物;將豬攝病毒兔化弱毒疫苗株接種轄牛睪丸細(xì)胞，收集48~72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0016] 本發(fā)明還供了所述試劑盒檢巧UPRRSV、PCV2、PRV和CSFV的方法，包括W下步驟：
[0017] 1、病毒RNA的提取
[001引 （1)將25化L經(jīng)過預(yù)處理的待測樣品加入75化L TRIzol LS Reagent中，劇烈振蕩 2min，室溫放置5min。加入250化氯仿，劇烈振蕩Imin，室溫放置5min后，4°C 12，000巧m離屯、 15min,將上層水相轉(zhuǎn)入新的罔·<L·、官。
[0019] (2)加入與水相等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置15min，4°C12,000巧m離屯、15min， 輕輕倒去上清，然后加入DEPC處理的75%乙醇700~80化L，4°C 12,0(K)rpm離屯、5min，棄上 清。
[0020] (3)將沉淀自然風(fēng)干或于50°C干燥箱中驚干，用適量無核酸酶水充分溶解后立即 進(jìn)行PCR或膽存于-80°C備用。
[0021] 待測樣品可為肺臟、淋己結(jié)、脾臟、腎臟。其中，待測樣品預(yù)處理的方法為:將待測 樣品剪碎后，按照1:5的質(zhì)量體積比加入生理鹽水并研磨均勻，3000~5000巧m離屯、5~10分 鐘后取上清，之后再進(jìn)行RNA的提取。
[0022] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0023] 取上述步驟所得的病毒總RNA 1化L，加入化L ΙΟμΜ的反轉(zhuǎn)錄引物，化L 5X反轉(zhuǎn)錄 緩沖液、0.5化反轉(zhuǎn)錄酶、0.5化RNA酶抑制劑、2化dNTP Mixture至20化，42°C水浴1~化， 即得到cDNA溶液。
[0024] 2、病毒DNA的提取
[0025] 將20化L經(jīng)過預(yù)處理的待測樣品用蛋白酶K消化比，加入250ul乙醇滿旋混勻，靜置 5min，用洗液洗涂2次，12000;r/min離屯、2min，將沉淀自然風(fēng)干后，溶于適量無核酸酶的水中 膽存于-80°C備用。
[0026] 3、多重PCR反應(yīng)
[0027] 在反應(yīng)管中加入10化2XPCR MixaiiL上述cDNA溶液、1化上述DNA溶液，0.5化10 liM的上游引物、0.5化1 OiiM的下游引物，最后加入無核酸酶水至總體積為20化。
[002引混勻后按如下反應(yīng)程序進(jìn)行:94°C3min，1個(gè)循環(huán);94°C10s，55°C30s，72°C30s，共 30個(gè)循環(huán);72°C5min 1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若出 現(xiàn)32化P大小的條帶則待測樣品含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒;若出現(xiàn)44化P大小的條帶則 待測樣品含有豬圓環(huán)病毒2型;若出現(xiàn)359bp大小的條帶則待測樣品含有豬偽狂犬病毒;若 出現(xiàn)18化P大小的條帶則待測樣品含有豬攝病毒。
[0029] 本發(fā)明還要求保護(hù)上述所述引物組合物，并提供了所述引物組合物在檢測PRRSV、 PCV2、PRV和CSFV中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供了四對檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán) 病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬攝病毒的特異性引物，利用其制成的多重PC時(shí)式劑盒，能夠快 速、特異的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬攝病毒。
【附圖說明】
[0031] 圖1是豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬攝病毒多重 PCR特異性檢測結(jié)果;Μ:DL2000 Marker; 1:四種病毒;2:豬圓環(huán)病毒2型；3:豬偽狂犬病毒； 4:豬繁殖與呼吸綜合征病毒;5:豬攝病毒;6:豬細(xì)小病毒;7:豬流行性腹瀉病毒;8:陰性對 照；
[0032] 圖2是豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬攝病毒多重 PCR敏感性檢測結(jié)果;M:DL2000 Marker;l~6依次為1(Τ?~10-7倍比稀釋病毒核酸的擴(kuò)增產(chǎn) 物。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述掲示 的技術(shù)內(nèi)容加 W變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對W下實(shí)