一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有篩選方法主要是通過將乙醇提取物加入感染細(xì)胞，使病毒感染細(xì)胞。一定時(shí) 間后觀察細(xì)胞的形態(tài)，如細(xì)胞病變的情況，只能定性地了解抗病毒效果，而不能定量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供篩選方便且抗病毒能力強(qiáng)的一種篩選抗病毒 植物乙醇提取物的方法。
[0004] 本發(fā)明提供了一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步驟S1，確定細(xì)胞無(wú) 毒濃度:分組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同種類、不同濃度的植物乙醇提取物，W選取各組中 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒影響的植物乙醇提取物;S2:病毒感染:將獲得的對(duì)細(xì)胞無(wú)毒影響的植物乙醇提 取物加入細(xì)胞中，使病毒感染細(xì)胞，S3:巧光素酶檢測(cè):通過測(cè)定巧光素酶活力反映病毒的 增值情況，從而篩選出抗病毒植物乙醇提取物。
[0005] 本發(fā)明一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，其優(yōu)點(diǎn)是:通過巧光素酶檢測(cè)原 理，采用病毒IBV-3ab-luc、感染細(xì)胞H1299作為原材料，簡(jiǎn)單、有效地篩選出抗病毒能力強(qiáng) 的植物乙醇提取物。
【具體實(shí)施方式】
[0006] 本發(fā)明提供了一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步驟S1，確定細(xì)胞無(wú) 毒濃度:分組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同種類、不同濃度的植物乙醇提取物，W選取幾組實(shí) 驗(yàn)濃度中對(duì)細(xì)胞無(wú)毒影響的植物乙醇提取物;S2:病毒感染:將獲得的對(duì)細(xì)胞無(wú)毒影響的植 物乙醇提取物加入細(xì)胞中，使病毒感染細(xì)胞，S3:巧光素酶檢測(cè):通過測(cè)定巧光素酶活力反 映病毒的增值情況，從而篩選出抗病毒植物乙醇提取物。
[0007] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，當(dāng)然所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分 實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞 動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[000引優(yōu)選地，一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括W下步驟：
[0009] 步驟S1，確定細(xì)胞無(wú)毒濃度:將至少一種植物乙醇提取物分別用75 %~85 %的乙 醇做溶劑，再等倍稀釋成至少一個(gè)濃度，放入3°~5°冰箱中備用;培養(yǎng)至少一組細(xì)胞，將稀 釋好的植物乙醇提取物加入細(xì)胞中，作為對(duì)照組，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，48~52小時(shí)后，在倒置 顯微鏡下觀察經(jīng)不同濃度的植物乙醇提取物處理后的細(xì)胞的形態(tài)變化;若細(xì)胞輪廓變形， 粗糖，或聚合脫落視為該濃度的植物乙醇提取物對(duì)細(xì)胞有毒害，從而選取幾組實(shí)驗(yàn)濃度中 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒影響的植物乙醇提取物。
[0010] 進(jìn)一步地，培養(yǎng)細(xì)胞具體操作為：在12孔板中均用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 化299,且每孔的培養(yǎng)液體積為0.8~1.2ιΛ;加入每孔細(xì)胞中的植物乙醇提取物的量為4.8 ~7.如1〇
[0011] 進(jìn)一步地，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底部80%時(shí)，再將稀釋后的植物乙醇提取物加入細(xì) 胞；
[0012] 進(jìn)一步地，選取的每種植物的每個(gè)濃度至少對(duì)應(yīng)一組細(xì)胞。
[0013] 優(yōu)選地，一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括W下步驟：
[0014] 包括步驟S2，病毒感染:待多組孔板中細(xì)胞的覆蓋達(dá)到80 %至90 %時(shí)，分別加入步 驟S1中獲得的植物乙醇提取物，且此植物乙醇提取物的濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)毒影響;放入培養(yǎng)箱， 24h后，用病毒感染細(xì)胞；
[0015] 進(jìn)一步地，每孔細(xì)胞中加入的植物乙醇提取物為4.8~7.化1;
[0016] 優(yōu)選地，所述病毒為攜帶有巧光素酶基因的重組病毒IBV-3ab-luc;且每孔病毒的 加入量為80~120ul;所述細(xì)胞為人肺癌細(xì)胞化299。
[0017] 優(yōu)選地，一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括W下步驟：
[0018] 包括步驟S3，巧光素酶檢測(cè)：病毒感染細(xì)胞2地后，去上清液、洗涂，然后每孔加入 細(xì)胞裂解液化B100~120ul;刮下細(xì)胞后凍融，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌EP管中，滿旋、離屯、， 取上清液至另一無(wú)菌EP管中，加入底物巧光素15~25ul，充分混合后，放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器 中檢測(cè)，至少讀數(shù)3次，取平均值，最后將溶劑對(duì)照與各處理的數(shù)值相比，數(shù)量級(jí)大，表明植 物乙醇提取物的抗病毒能力強(qiáng)，反之，則弱。
[0019] 進(jìn)一步地，所述洗涂采用ImL的PBS對(duì)每孔清洗2~5次；
[0020] 進(jìn)一步地，用槍頭刮下細(xì)胞，再凍融一次；
[0021 ] 進(jìn)一步地，所述滿旋時(shí)間為15~18s，離屯、條件為1000化pm，2min;所取上清液15~ 25ul至另一新EP管中。
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例為本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0023] 實(shí)施例一：
[0024] -種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括如下步驟：
[0025] 步驟S1，確定細(xì)胞無(wú)毒濃度:分別選用75%乙醇浸泡麥冬根、構(gòu)杞果、車前葉、Ξ屯 葉7dW上，獲取麥冬根、構(gòu)杞果、車前葉、Ξ屯葉的乙醇提取物(提取方法為常規(guī)方法，在廣 口瓶中，壓緊植物材料，根據(jù)植物的體積，W80 %乙醇剛好完全淹沒植物材料為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù) 植物質(zhì)量和乙醇體積，確定初始濃度分別為2.7240g/mL、3.0272g/mL、1.6080g/mL和 1.8632g/mL)，將獲得的4種乙醇提取物分別再用80%乙醇做溶劑等倍(2X)稀釋成5個(gè)濃度 (具體如下表1所示），放入4°冰箱中備用；在12孔板中均用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 H1299，且每孔的培養(yǎng)液體積為1.待細(xì)胞H1299鋪滿培養(yǎng)板底部80 %時(shí)，每孔加入7.化1 稀釋好的植物乙醇提取物至細(xì)胞H1299中（保證細(xì)胞液中乙醇濃度為0.48%，前期試驗(yàn)得出 此濃度對(duì)細(xì)胞沒有影響），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，48小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察各濃度提取物 處理后細(xì)胞H1299的形態(tài)變化;若細(xì)胞輪廓變形，粗糖，或聚合脫落視為該濃度的植物乙醇 提取物對(duì)細(xì)胞化299有毒害，依此確定植物乙醇提取物的最大無(wú)毒濃度，結(jié)果如下表：
[00%] 表1四種植物乙醇提取物不同濃度處理細(xì)胞化29924h后細(xì)胞的形態(tài)變化
[0027]
[0028] 由表1數(shù)據(jù)看出：麥冬根、構(gòu)杞果、車前葉和Ξ屯葉的最大無(wú)毒濃度分別為 0.3405g/mL、0.3784g/mL、0.4020g/mL和 0.9316g/mL，后續(xù)用該濃度進(jìn)行試驗(yàn)。
[0029] S2:病毒感染:待孔板中細(xì)胞的覆蓋達(dá)到80%至90%時(shí)，向各孔細(xì)胞化299中加入 7.2ul步驟S1獲得的最大無(wú)毒濃度的植物乙醇提取物，進(jìn)行對(duì)照；放入培養(yǎng)箱，24h后，用 120ul攜帶有巧光素酶基因的重組病毒IBV-3ab-luc(M0I = 0.1)感染每孔中的人肺癌細(xì)胞 H1299;
[0030] S3，巧光素酶檢測(cè)：病毒感染細(xì)胞2地后，去上清液，用ImL的PBS每孔清洗4次，然后 每孔加入細(xì)胞裂解液化B120U1;用槍頭充分刮下細(xì)胞H1299后凍融一次，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至一 無(wú)菌EP管中，滿旋15s，用100(K)rpm離屯、2min，取25ul上清液至另一無(wú)菌EP管中，加入底物巧 光素25ul，充分混合后，迅速放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器中檢測(cè)，讀取數(shù)據(jù)3次，取平均值。抗病毒 能力評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn):將溶劑對(duì)照與各處理的數(shù)值相比，比值的數(shù)量級(jí)數(shù)作為抑制效力參考指 標(biāo)，數(shù)量級(jí)大，表明植物乙醇提取物的抗病毒能力強(qiáng)，反之，則弱。具體結(jié)果見下表2所示：
[0031] 表2不同乙醇提取物檢測(cè)巧光值及抑制效力
[0032]
[0033] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)論為:Ξ屯葉乙醇抑制效力達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí)，提取物抗病毒效果最佳， 其次為車前葉、麥冬。而構(gòu)杞果乙醇提取物幾乎沒有抗該病毒的效果。
[0034] 實(shí)施例二：
[0035] 一種篩選抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括如下步驟：
[0036] 步驟S1，確定細(xì)胞無(wú)毒濃度:分別選用85%乙醇浸泡魚腥草葉、決明子、薄荷葉7d W上，獲取魚腥草葉、決明子、薄荷葉的乙醇提取物(提取方法為常規(guī)方法，在廣口瓶中，壓 緊植物材料，根據(jù)植物的體積，W85%乙醇剛好完全淹沒植物材料為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)植物質(zhì)量和 乙醇體積，確定初始濃度分別為2.4960g/mL、1.2492g/mL和1.7488g/mL)，將獲得的巧巾乙醇 提取物分別再用80%乙醇做溶劑等倍(2X)稀釋成5個(gè)濃度(具體如下表3所示），放入3°冰箱 中備用；在12孔板中均用RPMI -1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞H1299，且每孔的培養(yǎng)液體積為ΙιΛ;待 細(xì)胞Η1299鋪滿培養(yǎng)板底部80%時(shí)，向每孔加入6ul稀釋好的植物乙醇提取物至細(xì)胞Η1299 中（保證細(xì)胞液中乙醇濃度為0.48 %，前期試驗(yàn)得出此濃度對(duì)細(xì)胞沒有影響），放入細(xì)胞培 養(yǎng)箱，50小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察各濃度提取物處理后細(xì)胞H1299的形態(tài)變化;若細(xì)胞 輪廓變形，粗糖，或聚