清洗基于a蛋白的親和色譜柱的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供清洗A蛋白色譜柱的方法。而且，本發(fā)明設及清洗基于A蛋白的親和色 譜柱的方法，所述親和色譜柱采用的親和色譜介質包含基于金黃色葡萄球菌 (Staphylococ州S aureus)蛋白的C結構域的配體。
【背景技術】
[0002] 本申請包含WASCII形式電子提交的序列表，并且其整體援引加入本文。2014年6 月3日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝名為P13-136PCT_^. txt，大小為6，289字節(jié)。
[0003] 蛋白純化的常規(guī)方法通常包括細胞培養(yǎng)方法，例如利用重組工程化的哺乳動物或 細菌細胞系產生所關注的蛋白，然后：（a)用于去除細胞和細胞碎片的澄清步驟，例如利用 差速離屯、和/或過濾；W及(b)-個或多個下游色譜步驟W分離所關注的蛋白與澄清的細胞 培養(yǎng)進料中的各種雜質。
[0004] 在單克隆抗體和其他包含Fc的蛋白的情況下，純化的行業(yè)標準通常包括多步過 程。重要步驟之一是純化步驟，其采用稱作A蛋白的結合抗體的Fc區(qū)的親和配體。通常，在運 個步驟中去除大百分比的雜質。雖然，在抗體的純化中A蛋白親和色譜是非常有效的步驟， 但是使用A蛋白的一個缺點是與離子交換樹脂相比其非常昂貴。親和色譜柱的進一步包裝 和解包也是非常勞動密集型的，并且?guī)盹@著的緩沖液成本。因此，能夠清洗、重復使用并 消毒A蛋白柱幾個循環(huán)是可取的。
[000引目前，利用堿性條件或酸性條件清洗采用大多數可商購的A蛋白介質的色譜柱。例 如，利用堿性溶液如氨氧化鋼清洗采用MabSe 1 eCtS雌'6敏（GE)、KanCap A化aneka)和 ToyoPea討愈AF-rProtein A 650F(Tosoh)介質的色譜柱，然而，采用 ProS.ep愈Ultra Plus介質化MD Millipore Co巧oration)的色譜柱使用酸性溶液用于清洗。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供清洗色譜柱的方法，所述色譜柱采用包含固定在固體支持物上的基于 金黃色葡萄球菌A蛋白的C結構域的配體的介質，其中所述柱可W利用酸性和堿性兩種溶液 清洗。
[0007] 如上文討論的，由于A蛋白配體或基底基質對延長暴露于酸性或堿性溶液的不穩(wěn) 定性，可W利用酸性溶液或堿性溶液清洗采用大多數可商購的A蛋白介質的色譜柱。相應地 建立采用運樣的色譜柱的純化方法，W便適應僅在堿性條件下清洗或僅在酸性條件下清 洗。
[0008] 本發(fā)明的方法使得除了在堿性條件下清洗W外或作為在堿性條件下清洗的替代， 能夠在酸性條件下清洗采用包含固定在固體支持物上的基于A蛋白的C結構域的配體的介 質的色譜柱，從而提供更大的操作靈活性。通過使得能夠高效清洗采用運樣的介質的色譜 柱，本文所述的方法能夠在許多循環(huán)中保留柱的結合能力。此外，通過使得能夠清洗采用運 樣的介質的色譜柱，與單獨利用堿性條件或酸性條件清洗相比，實現更大的雜質去除，從而 導致更大的產物純度。
[0009] 在一些實施方案中，提供一種經歷一個或多個親和純化循環(huán)后仍保留親和色譜柱 的結合能力的方法，所述方法包括在一個或多個親和純化循環(huán)之后用抑低于3.0的酸性溶 液清洗所述色譜柱，其中所述親和色譜柱包含運樣的介質，所述介質包含固定在固體支持 物上的源自金黃色葡萄球菌A蛋白的C結構域的A蛋白配體，所述固體支持物包含選自W下 的聚合物:聚乙締酸、聚乙締醇、聚甲基丙締酸醋、聚丙締酸醋、聚苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲 基丙締酷胺和聚碳酸醋。
[0010] 在一些其他實施方案中，提供一種利用酸性和堿性兩種溶液清洗親和色譜柱的方 法，其中所述方法包括：（a)循環(huán)之后使所述柱與酸性和堿性兩種溶液接觸;或者(b)循環(huán)之 后使所述柱與酸性溶液接觸或循環(huán)之后使所述柱與堿性溶液接觸，從而所述酸性和堿性溶 液W交替方式使用，其中所述親和色譜柱包含運樣的介質，所述介質包含固定在固體支持 物上的源自金黃色葡萄球菌A蛋白的C結構域的A蛋白配體。
[0011] 在一些實施方案中，所述A蛋白配體包含選自SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4的氨基 酸序列。
[0012] 在一些實施方案中，所述固體支持物包含選自W下的聚合物：聚乙締酸、聚乙締 醇、聚甲基丙締酸醋、聚丙締酸醋、聚苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲基丙締酷胺和聚碳酸醋。在 一具體實施方案中，所述固體支持物包含聚乙締酸聚合物。
[0013] 在一些實施方案中，所述酸性溶液的pH為1.5，或pH為2.0，或pH為2.5。
[0014] 在一些實施方案中，所述結合能力在經歷10個或更多個循環(huán)后仍得W保留。在其 他實施方案中，所述結合能力在經歷50個或更多個循環(huán)后仍得W保留。在其他實施方案中， 所述結合能力在經歷100個或更多個循環(huán)后仍得W保留。在其他實施方案中，所述結合能力 在經歷200個或更多個循環(huán)后仍得W保留。
[0015] 本文還提供一種在使用之后消毒親和色譜柱同時保持所述柱的結合能力的方法， 其中所述方法包括使所述親和色譜柱與包含憐酸、乙酸和苯甲醇的溶液接觸至少3小時，并 且其中所述親和色譜柱包含固定在固體支持物上的源自金黃色葡萄球菌A蛋白的C結構域 的A蛋白配體，所述固體支持物選自聚乙締酸、聚乙締醇、聚甲基丙締酸醋、聚丙締酸醋、聚 苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲基丙締酷胺和聚碳酸醋。
【附圖說明】
[0016] 圖1為示出實驗結果的條形圖，所述實驗在暴露于W下溶液時測量樹脂A、B和C保 留的靜態(tài)結合能力百分比：（1)0.3%鹽酸，pH 1.5:(2)0.15M憐酸，pH 1.5:(3)0.1M化0H; 和(4)0.5M NaOH，暴露25虹，運等于100個循環(huán)（W 15min/循環(huán)）。全部3個樹脂樣品均證實相 對于對照，在暴露于0.3%肥1和0.151出斷4時，2化'暴露之后保留超過95%結合能力。相對 于對照，樹脂A和B在暴露于0.1M化0H時保留超過95%結合能力。相對于對照，樹脂A和B在 暴露于0.5M NaOH時保留約75%結合能力。相對于對照，樹脂C在暴露于0.1M化0邸寸保留約 65%結合能力。相對于對照，樹脂C在暴露于0.5M化0H時保留約38%結合能力。標準差為約 3%。
[0017] 圖2為示出實驗結果的條形圖，所述實驗測量樹脂B暴露于W下的100和200個循環(huán) 之后保留的動態(tài)結合能力百分比（在4min停留時間10%): (1)通過每10個循環(huán)交替0.1M 化OH和ο. 15M憐酸，pH 1.5清洗；（2)僅用憐酸清洗；W及(3)僅用ο . IM化OH堿性溶液清洗。 交替暴露于憐酸和化0H和0.15M H3PO4200 個循環(huán)（15min/循環(huán)）之后；僅暴露于0.15M 出P04200個循環(huán)（15min/循環(huán))之后，或者暴露于0.1M化0H 200個循環(huán)（15min/循環(huán))之后未 觀察到動態(tài)結合能力的顯著變化(10%突破）。標準差為約10%。
【具體實施方式】
[0018] A蛋白親和色譜包括包含Fc的蛋白（例如，免疫球蛋白或另一Fc-融合蛋白）結合至 包裝在柱中的A蛋白樹脂或介質（即，固定在固體支持物上的A蛋白配體），隨后從柱洗脫包 含Fc的蛋白。原位清洗(CIP)對于色譜柱的高效使用W及最大化柱可W重復使用的循環(huán)數 至關重要。一般需要有效去除雜質且對色譜樹脂無害的清洗方法。通常用于大多數可商購 的A蛋白樹脂的清洗W及消毒的最常見的清洗溶液之一是氨氧化鋼（NaOH)(參見例如， Hagel L et.al.Handbook of Process Chromatography-Development.Manufacturing, Validation and Economics . Second edition.London,UK:Academic Press ； 2008.Cleaning and Sanitization;pp.147-159;Gronberg et al.,MAbs.2011Mar-Apr;3 (2): 192-202)。通常，當W柱模式進行許多隨后的循環(huán)時，在色譜柱上可能存在污染物的逐 漸積累，引起柱的污染W及柱的效率和結合能力降低。循環(huán)之間的高效清洗方法最小化色 譜柱上的污染物積累，從而延長柱的壽命。運也稱作柱再生。
[0019] 雖然利用堿性溶液如氨氧化鋼清洗大多數可商購的A蛋白樹脂，但是利用憐酸 (也P〇4)清洗ProSep?叫tra Plus樹脂（EMD Millipore Corporation)。
[0020] 本發(fā)明至少是基于令人驚訝和出乎意料的發(fā)現，可W用酸性和堿性兩種溶液清洗 采用介質的色譜柱，所述介質包含固定在固體支持物上的基于金黃色葡萄球菌A蛋白的C結 構域的配體。通過使得能夠用酸性和堿性兩種溶液清洗柱，不僅獲得更大的操作靈活性，而 且在純化過程中使用堿性和酸性兩種溶液清洗時，獲得更大的蛋白純度。
[0021] 為了可W更容易地理解本公開，首先定義某些術語。額外的定義在整個詳細說明 書中示出。
[0022] I.定義
[0023] 如本文所用，術語"SpA"、"A蛋白"或"金黃色葡萄球菌A蛋白"指分離自細菌金黃色 葡萄球菌的42kDa多結構域蛋白。SpA通過其稱作X結構域的簇基端細胞壁結合區(qū)結合至細 菌細胞壁。在氨基端區(qū)，其包括5個免疫球蛋白結合結構域，稱作E、D、A、B和C(Sjo化al，Eur J Biochem.Sep78(2) :471-90(1977) ;Uhlen et al.J Biol ChemJeb 259(3):1695-702 (1984))。運些結構域每個均包含約58個氨基酸殘基，并且它們享有65-90%氨基酸相同性。
[0024] SpA的E、D、A、B和C結構域每個均具有不同的Ig-結合位點。一個位點是對化（Ig的 IgG類別的恒定區(qū)），而另一個是對某些Ig分子的化b部分(負責抗原識別的Ig部分）。已報道 每個結構域均包含化b結合位點。SpA的非Ig結合部分位于C-端，并且命名為X區(qū)或X-結構 域。
[002引在本文中可交換使用的術語乂結構域"、"SpA的C結構域"、"A蛋白的C結構域"和 "金黃色葡萄球菌（51日911710(30(3(3113日11'6113)4蛋白的(：結構域"指其氨基酸序列在560 10 N0:1中示出或由例如SEQ ID N0:2示出的核巧酸序列編碼的多膚。乂結構域"是折疊為Ξ螺 旋束結構的58個氨基酸多膚。其能夠通過螺旋1和2表面上的殘基結合Fc，或者通過螺旋2和 3表面上的殘基結合化b。
[0026] 如本文所述方法中使用的基于A蛋白的C結構域的A蛋白配體包括具有與SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列至少80%、或至少85 %、或至少90 %或至少95 %或更多相同的氨基酸 序列的配體。
[0027] 在各種實施方案中，用于本文所述方法的基于A蛋白的C結構域的A蛋白配體包含 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0028] 如本文所用，術語"色譜"指一種動態(tài)分離技術，其將祀分子如祀蛋白（例如，免疫 球蛋白或另一包含Fc的蛋白）與混合物中的其他分子分開并允許將其分離。通常，在色譜方 法中，流動相(液體或氣體)運送包含所關注的祀分子的樣品穿過或通過固定相(通常為固 體)介質。對固定相