制備眼前段組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及用于在體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成眼前段組織的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]迄今為止，本發(fā)明人使用SFEBq方法(專利文件I)通過在不含血清的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞聚集體，并且通過體外自組織形成視杯(其是眼原基)(專利文件2，非專利文件I和2)已經(jīng)成功地開發(fā)了包含來自多能干細(xì)胞的神經(jīng)視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜色素上皮組織的視網(wǎng)膜前體組織。然而，通過體外懸浮培養(yǎng)由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)與視網(wǎng)膜一起組成眼球的眼前段組織(如角膜、晶狀體等)還未見報(bào)道。
[0003]非專利文件3報(bào)道了通過在PA6飼養(yǎng)層上貼壁培養(yǎng)人iPS細(xì)胞而誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞。然而，在飼養(yǎng)細(xì)胞存在下的培養(yǎng)不是優(yōu)選的，因?yàn)閼?yīng)當(dāng)避免不確定因素的污染。另外，角膜等的立體結(jié)構(gòu)還未被構(gòu)建。該文件中所述的方法需要12周的長時(shí)期來誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞。該文件還描述了BMP4處理抑制iPS細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞。
[0004]非專利文件4描述了通過在BMP4、BMP7和FGF2存在下貼壁培養(yǎng)人ES細(xì)胞來誘導(dǎo)晶狀體前體細(xì)胞。非專利文件5描述了通過在PA6飼養(yǎng)層上貼壁培養(yǎng)小鼠iPS細(xì)胞而誘導(dǎo)角膜上皮。非專利文件6描述了通過在飼養(yǎng)細(xì)胞存在下貼壁培養(yǎng)人ES細(xì)胞而誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞。非專利文件7描述了通過貼壁培養(yǎng)將人ES細(xì)胞誘導(dǎo)為角膜樣細(xì)胞。然而，這些文件無一公開懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞來在空間上形成眼前段組織，如角膜、晶狀體等。
[0005][文件列表]
[0006]專利文件
[0007]專利文件1:W0 2009/148170
[0008]專利文件2:WO2011/055855
[0009][非專利文件]
[0010]非專利文件I=Nakano等人，Cell Stem Cell ,10(6):771-785,2012[0011 ]非專利文件2:Eiraku等人，Nature，472(7341): 51-56，2011
[0012]非專利文件3:Hayashi等人，PLOSONE,7(9):e45435,2012
[0013]非專利文件4:Yang等人，F(xiàn)ASEBJ.,24:3274-3283,2010
[0014]非專利文件5:Yoshida等人，PLOSONE,6(12):e28856,2011
[0015]非專利文件6:Chan等人，PLOSONE,8(2):e56831,2013
[0016]非專利文件7:Ahmad等人，StemCells,25:1145-1155,2007
[0017]發(fā)明概述
[0018]發(fā)明要解決的問題
[0019]本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞選擇性分化為眼前段組織或其前體組織的高度實(shí)用的方法。
[0020]解決問題的方式
[0021]本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，并且發(fā)現(xiàn)通過在懸浮培養(yǎng)下用BMP4處理人多能干細(xì)胞的聚集體可以誘導(dǎo)眼前段組織(晶狀體和角膜)的自組織，并且有效地進(jìn)行角膜和晶狀體的立體形成。通過在由本發(fā)明人開發(fā)的誘導(dǎo)立體視網(wǎng)膜自組織的方法(SFEBq法)的初始過程中實(shí)施BMP4處理，其已經(jīng)成功地在聚集體中形成的視網(wǎng)膜上皮組織聚集體的表面上以自組織的方式形成表面外胚層，并且自發(fā)地引起可見于活體胚胎的“通過視網(wǎng)膜的表面外胚層向眼前段前體組織(晶狀體基板和角膜基板)的分化誘導(dǎo)”。結(jié)果，可以立體地形成自組織的視網(wǎng)膜在內(nèi)部，并且增厚的晶狀體和角膜上皮前體組織在表面中的懸浮的聚集體。
[0022]他們還通過連續(xù)培養(yǎng)所述懸浮的聚集體而成功地使所述聚集體內(nèi)的晶狀體基板自發(fā)內(nèi)陷，并且形成晶狀體泡。
[0023]成年人的角膜從表面到內(nèi)部由三層組成:上皮、間質(zhì)和內(nèi)皮。通過長期培養(yǎng)上述聚集體，他們還成功地允許聚集體表達(dá)多種在成人角膜上皮中觀察到的標(biāo)記蛋白。盡管已知間質(zhì)和內(nèi)皮由來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育而來，而不是由表面外胚層而來，當(dāng)長期培養(yǎng)上述聚集體時(shí)，除了視網(wǎng)膜組織和角膜上皮組織之外，間充質(zhì)細(xì)胞也可以在所述聚集體中發(fā)育，其結(jié)果是，他們發(fā)現(xiàn)，可以形成具有聯(lián)合的角膜上皮層和間充質(zhì)細(xì)胞層(對應(yīng)于間質(zhì)和內(nèi)皮)的立體角膜。
[0024]本發(fā)明人基于上述發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究并且完成了本發(fā)明。
[0025]因此，本發(fā)明如下:
[0026][I]包含眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)或其前體組織的制備方法，所述方法包括在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)存在下，懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞的聚集體。
[0027][2][1]的方法，其中在所述在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)存在下的懸浮培養(yǎng)之前，在不存在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的情況下懸浮培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞的聚集體。
[0028][3][1]或[2]的方法，其中所述骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是BMP4。
[0029][ 4 ] [ 3 ]的方法，其中BMP4具有卜5nM的濃度。
[0030][5][1]_[4]中任一項(xiàng)的制備方法，其中所述懸浮培養(yǎng)完全或部分地在成纖維細(xì)胞生長因子存在下進(jìn)行。
[0031][6][1]_[5]中任一項(xiàng)的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
[0032][7][1]_[6]中任一項(xiàng)的方法，其中所述多能干細(xì)胞來源于人。
[0033][8] [1]_[7]中任一項(xiàng)的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下進(jìn)行。
[0034][9][1]_[8]中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞聚集體還包含神經(jīng)視網(wǎng)膜組織。
[0035][10][1]_[9]中任一項(xiàng)的方法，其中所述眼前段組織是角膜和/或晶狀體。
[0036][11][1]-[10]中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞聚集體包含作為所述眼前段組織的部分結(jié)構(gòu)的角膜上皮，并且還包含間充質(zhì)組織或來源于其的膠膜間質(zhì)和/或角膜內(nèi)皮。
[0037][ 12] [ 11 ]的方法，其中所述角膜上皮是分層的。
[0038][13][1]_[12]中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括從所述細(xì)胞聚集體分離所述眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)或其前體組織。
[0039][14][13]的方法，其中所述眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)或其前體組織與神經(jīng)視網(wǎng)膜組織一起分離。
[0040][ 15 ]通過[I ] _[ 12 ]中任一項(xiàng)的方法獲得的細(xì)胞聚集體。
[0041][16]眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)或其前體組織，其是由[13]或[14]的方法獲得的。
[0042]發(fā)明效果
[0043]按照本發(fā)明，可以在能夠提供高通量的懸浮培養(yǎng)下立體形成眼前段組織(如晶狀體、角膜等)或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織。
[0044]按照本發(fā)明，能夠以常規(guī)方法難以達(dá)到的高的效率由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)眼前段組織(如晶狀體、角膜等)或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織。在一個(gè)在具有相當(dāng)小的體積的培養(yǎng)隔室(如96孔板)中形成聚集體的實(shí)施方案中，可以以不低于80%的效率形成包含角膜前體組織的聚集體，并且可以以不低于20%的效率獲得包含晶狀體前體組織的細(xì)胞聚集體。
[0045]按照本發(fā)明，可以在“短時(shí)間”內(nèi)由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)眼前段組織(如晶狀體、角膜等)或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織，而這是常規(guī)方法難以達(dá)到的。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，能夠在自分化培養(yǎng)開始起約3周內(nèi)由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)晶狀體和角膜上皮，而這在常規(guī)上至少需要兩倍長的時(shí)間。
[0046]按照本發(fā)明，能夠由多能干細(xì)胞鄰接地立體形成在活體的眼中共存的視網(wǎng)膜、晶狀體和角膜。因此，可以復(fù)制與體內(nèi)相似的非人工組織發(fā)育培養(yǎng)環(huán)境。
[0047]按照本發(fā)明，角膜上皮和與其鄰接的神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)組織(其形成角膜內(nèi)皮和角膜間質(zhì))可以在聚集體中同時(shí)形成，從而產(chǎn)生層狀的具有上皮、間質(zhì)和內(nèi)皮的前體組織的角膜前體組織。
[0048]按照本發(fā)明，可以形成角膜上皮，所述角膜上皮具有成熟角膜所特有的層狀上皮結(jié)構(gòu)，包括作為表層的鱗狀上皮和作為深層的立方上皮。
[0049]按照本發(fā)明，可以在聚集體的表層上選擇性地形成角膜前體組織，并且，甚至在不使用FACS等的情況下，就能夠以高純度分離角膜祖細(xì)胞。
[0050]附圖簡述
[0051 ][圖1A]圖1A顯示在添加BMP4的條件下，在由SFEBq方法獲得的人ES細(xì)胞聚集體(第14天)的表層中形成不同于神經(jīng)視網(wǎng)膜的Rx::venus陰性的、E-鈣黏著蛋白陽性的上皮細(xì)胞層。
[0052][圖1B]圖1B顯示在添加BMP4的條件下在由SFEBq方法獲得的人ES細(xì)胞聚集體(第24天)的表層中形成的上皮細(xì)胞層是廣譜細(xì)胞角蛋白(pancytokeratin)陽性的。
[0053][圖1C]圖1C顯示在添加BMP4的條件下在由SFEBq方法獲得的人ES細(xì)胞聚集體(第24天)的表層中形成L-Maf陽性的晶狀體基板樣組織，其中上皮細(xì)胞層增厚。
[0054][圖2]圖2顯示在添加BMP4的條件下由SFEBq方法獲得的人ES細(xì)胞聚集體(第55天)的表層中形成的上皮組織表達(dá)角膜上皮特有的細(xì)胞角蛋白3(CK3)、細(xì)胞角蛋白12(CK12)和細(xì)胞角蛋白14(CK14)。
[0055][圖3A]圖3A顯示在添加BMP4的條件下由SFEBq方法獲得的人ES細(xì)胞聚集體(第33天)的表層中的增厚的角膜上皮與神經(jīng)視網(wǎng)膜組織之間的間充質(zhì)細(xì)胞聚集體層中的TOGFR-α的表達(dá)。
[0056][圖3Β]圖3Β顯示在添加ΒΜΡ4的條件下由SFEBq方法獲得的人ES細(xì)胞聚集體(第53天)的表層中的增厚的角膜上皮與神經(jīng)視網(wǎng)膜組織之間的間充質(zhì)細(xì)胞聚集體層中的Pitx2和ABCG2的表達(dá)。
[0057][圖3C]圖3C顯示間充質(zhì)細(xì)胞聚集體層的最內(nèi)部中形成的上皮化的內(nèi)皮細(xì)胞層(epithelized endothelial cell layer)的形態(tài)學(xué)。
[0058][圖4A]圖4A顯示在添加bFGF的組中觀察到的晶狀體泡樣囊泡，其中觀察到具有沿前-后軸的形態(tài)極性(在前部薄，在后部厚)的晶狀體組織的形成，這是體內(nèi)晶狀體發(fā)育中可見的。
[0059][圖4B]圖4B顯示在不添加bFGF的組中觀察到的晶狀體泡樣囊泡。在添加bFGF的組中觀察到的組織極性是不清楚的。
[0060][圖5A]圖5A顯示CK3在分層的角膜上皮中的表達(dá)。
[0061 ][圖5B]圖5B顯示CK12在分層的角膜上皮中的表達(dá)。
[0062][圖5C]圖5C顯示CK15在分層的角膜上皮中的表達(dá)。
[0063][圖圖顯示Na-KATP酶在分層的角膜上皮中的表達(dá)。
[0064]實(shí)施方案描述
[0065]本發(fā)明提供包含眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體的制備方法，所述方法包括在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)存在下懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞的聚集體。
[0066]在下文中詳細(xì)地闡釋本發(fā)明。
[0067](I)多能干細(xì)胞
[0068]“多能干細(xì)胞”是指具有分化成組成身體的所有細(xì)胞的潛能(分化多能性)和經(jīng)由細(xì)胞分裂產(chǎn)生具有相同的分化能力的子細(xì)胞的潛能(自我復(fù)制能力)的細(xì)胞。
[0069]分化多能性可以通過將評價(jià)靶標(biāo)的細(xì)胞移植到裸鼠中并且檢測是否存在包含三個(gè)胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)的每種細(xì)胞的畸胎瘤的形成來評價(jià)。
[0070]多能干細(xì)胞的實(shí)例包括胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)等，并且多能干細(xì)胞沒有限制，只要其具有分化多能性和自我復(fù)制能力二者即可。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
[0071]例如，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)可以通過培養(yǎng)預(yù)植入的早期胚胎、構(gòu)成早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、單個(gè)卵裂球等而建立(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)室手冊)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(19