用于產(chǎn)生心外膜細(xì)胞的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于產(chǎn)生心外膜細(xì)胞的方法和組合物
[0001 ] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002]此是專利合作條約申請(qǐng)，其基于2013年9月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/877，618號(hào)的優(yōu)先權(quán)要求35U.S.C.§119的權(quán)益，所述美國臨時(shí)專利申請(qǐng)以全文引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明提供用于由PSC(包括hPSC)產(chǎn)生心血管譜系細(xì)胞的方法和組合物，以及用于產(chǎn)生心肌細(xì)胞和心外膜譜系細(xì)胞群體的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0004]在過去五年中，我們已經(jīng)發(fā)展出引導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stemcell，hESC)和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)(統(tǒng)稱為人類多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell) ;hPSC)分化成特定細(xì)胞類型，包括心血管譜系細(xì)胞類型的能力U。此成功很大程度上是基于將我們對(duì)模型生物體中譜系發(fā)育和組織形成的理解轉(zhuǎn)換成hPSC分化培養(yǎng)物、對(duì)于心血管系統(tǒng)，此方法已經(jīng)引起建立復(fù)制發(fā)育關(guān)鍵階段的分化方案，包括形成原條(primitive streak，PS)樣群體、誘導(dǎo)心血管中胚層以及由此中胚層指定心血管譜系3、4。發(fā)育生物學(xué)也已經(jīng)告知我們控制此發(fā)育進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)控途徑，包括需要活化素A/結(jié)節(jié)素(nodal)和BMP4信號(hào)傳導(dǎo)以產(chǎn)生PS/中胚層群體、和需要抑制β-連環(huán)蛋白(β-catenin)依賴性Wnt信號(hào)傳導(dǎo)以指定中胚層最終成為心血管4。最近研究已經(jīng)鑒別出對(duì)代表心血管發(fā)育不同階段的細(xì)胞群體具有特異性的表面標(biāo)記物。此標(biāo)記物組包括見于心血管中胚層上的KDR和PDGFRa5和存在于心血管祖細(xì)胞和經(jīng)分化心肌細(xì)胞上的SIRPA6。通過監(jiān)測(cè)KDR+TOGFRa+群體的出現(xiàn)，已經(jīng)展示不同hPSC系需要不同濃度的活化素A和BMP4以用于最佳中胚層誘導(dǎo)和心肌細(xì)胞發(fā)育5。
[0005]心外膜譜系來源于稱為前心外膜器官(proepicardial organ，PE0)的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)在小鼠中大約在胚胎階段(E)9.5時(shí)鄰接于心臟發(fā)育7。特征在于表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子維爾姆斯瘤I (Wilms Tumor I，WT1)和TBX18的前心外膜細(xì)胞在循環(huán)過程期間從PEO迀移到早期心臟管，并且迅速地對(duì)其進(jìn)行包封以形成外部上皮層，稱為心外膜。心外膜對(duì)正常心臟發(fā)育而言至關(guān)重要，并且用于支持腦室細(xì)胞快速增殖和致密區(qū)心肌形成。其也是心臟中若干主要細(xì)胞類型的來源，包括心臟成纖維細(xì)胞、冠狀血管平滑肌細(xì)胞和少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞。這些經(jīng)分化后代被稱為心外膜源性細(xì)胞(6口:^31(1丨31-(161'；^6(1 cell，EPDC)，并且經(jīng)由心外膜的上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(6口;[1:1161丨31-1:0-1116 8611(31150]^1 trans i t 1n，EMT)產(chǎn)生。譜系跟蹤研究表明心外膜也是心肌細(xì)胞的來源8、9。然而，鑒于用于跟蹤實(shí)驗(yàn)的基因的心外膜特異性不確定性，這些研究的解釋已經(jīng)受到質(zhì)疑1Q。
[0006]心外膜產(chǎn)生多種因子，包括視黃酸(retinoic acid，RA)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast生長(zhǎng)因，F(xiàn)GF)和膜島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGFs)，其中若干種對(duì)形成致密區(qū)心肌必需的腦室肌細(xì)胞增殖暫態(tài)階段而言至關(guān)重要。最近的研究已經(jīng)展示，IGF2是促進(jìn)腦室增殖的關(guān)鍵性心外膜源性因子n，并且RA經(jīng)由肝臟中促紅細(xì)胞生成素(6^1:111^0丨61:;[11<^0)的活化間接介導(dǎo)此功能，其隨后在心外膜中誘導(dǎo)]^212。也存在經(jīng)由胸腺素M(thymosin β4，Τβ4)的活性進(jìn)行心外膜心肌調(diào)控的證據(jù)，所述TM是G-肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合蛋白13。TM由發(fā)育中的心肌來產(chǎn)生，并且是正確心外膜發(fā)育和完整性所需的。
[0007]雖然正常成年人心外膜不表達(dá)WTUTBX18或RALDH214，但如心肌梗塞的損傷將導(dǎo)致此‘胎兒’基因程序上調(diào)，以及導(dǎo)致群體內(nèi)細(xì)胞增殖和EMT再活化。在梗塞期間注射TM增強(qiáng)這些變化并且預(yù)防心肌死亡，很可能是經(jīng)由從活化的心外膜細(xì)胞產(chǎn)生旁分泌因子14、15。成年人中的譜系跟蹤研究表明，此活化的心外膜具有一定的產(chǎn)生新心肌細(xì)胞的能力，并且此心原性潛力通過用TM使梗塞前的心臟預(yù)致敏來增強(qiáng)15。然而，與胎兒研究相同，此概念是有爭(zhēng)議的，因?yàn)樽罱芯课茨鼙砻餍耐饽?duì)梗塞后經(jīng)TM處理的心臟心肌的任何貢獻(xiàn)14。
[0008]體外研究已經(jīng)展示，外植體培養(yǎng)物中的心外膜細(xì)胞將經(jīng)歷EMT，并且響應(yīng)于Notch16、TGF017—19和I3DGFBB2q或TM15而產(chǎn)生ETOC。來自用TM預(yù)致敏的梗塞動(dòng)物的心外膜細(xì)胞在體內(nèi)分化成在外植體培養(yǎng)物中表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞15。
[0009]盡管這些進(jìn)步已經(jīng)使得能夠由hPSC高效并可擴(kuò)展地得到心肌細(xì)胞，但這些經(jīng)分化群體對(duì)于許多應(yīng)用不是最佳的，因?yàn)槠浜胁怀墒斓募?xì)胞并且不同心臟譜系細(xì)胞在其中包括心肌和心外膜的比例沒有得到明確界定。為了實(shí)現(xiàn)hPSC在心血管研究和治療性應(yīng)用中的潛力，將很可能需要開發(fā)更準(zhǔn)確表示人類心臟的培養(yǎng)系統(tǒng)和工程改造組織。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]—個(gè)方面包括一種由人類多能干細(xì)胞(hPSC)獲得心血管譜系細(xì)胞群體，任選地心肌細(xì)胞譜系細(xì)胞群體或心外膜譜系細(xì)胞群體的方法，其包含以下步驟:(a)使經(jīng)過BMP組分預(yù)致敏的hPSC與適合于誘導(dǎo)所述hPSC分化成心血管中胚層細(xì)胞群體的心血管中胚層規(guī)劃混合液在適合于所述規(guī)劃混合液滲透所述hPSC的條件下接觸，并且培養(yǎng)經(jīng)過接觸的hPSC持續(xù)一段時(shí)間以產(chǎn)生KDR+和PDGFRa+心血管中胚層細(xì)胞群體；(b)使所述心血管中胚層細(xì)胞群體與適合于指定NKX2-5+或WTl+心血管祖細(xì)胞群體的心血管祖細(xì)胞指定混合液在適合于所述指定混合液滲透所述心血管中胚層細(xì)胞群體的條件下接觸，并且培養(yǎng)經(jīng)過接觸的心血管中胚層細(xì)胞群體持續(xù)一段時(shí)間以產(chǎn)生NKX2-5+或WTl+心血管祖細(xì)胞群體；以及(d)使所述心血管祖細(xì)胞群體與成熟混合液在適合于所述成熟混合液滲透所述心血管祖細(xì)胞群體的條件下接觸，并且培養(yǎng)經(jīng)過接觸的心血管祖細(xì)胞群體持續(xù)一段時(shí)間以產(chǎn)生心血管群體，任選地為表達(dá)心臟肌I丐蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和/或SIRPA的心肌細(xì)胞譜系細(xì)胞和/或任選地表達(dá)WTi和/或包含心外膜源性細(xì)胞(Eroc)的心外膜譜系細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將由以下【具體實(shí)施方式】而變得顯而易見。然而，應(yīng)理解，【具體實(shí)施方式】和特定實(shí)例雖然指示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但僅以說明方式給出，因?yàn)閷?duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改將由此【具體實(shí)施方式】而變得顯而易知。
【附圖說明】
[0012]現(xiàn)將與附圖相關(guān)描述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，其中:
[0013]圖1.由hESC變成心肌細(xì)胞的指定。用于使hESC朝向心肌細(xì)胞譜系分化的方案流程，其突出顯示三個(gè)主要發(fā)育階段:1)中胚層誘導(dǎo)，2)心血管指定和3)成熟。將來自活化素A/BMP4誘導(dǎo)第4天的胚狀體(embryoid body，EB)的細(xì)胞以單層形式接種在經(jīng)明膠涂布的孔上。在VEGF (5ng/ml)、活化素/結(jié)節(jié)素(SB-431542 5.4μΜ)和Wnt (DKKl 150ng/ml)抑制劑的存在下，操控BMP路徑持續(xù)48小時(shí)的時(shí)段(D4-D6)。在指定后，將培養(yǎng)物維持在VEGF中持續(xù)9天，并且隨后通過流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)來分析cTnT+心肌細(xì)胞的存在。
[0014]圖2.BMP4調(diào)控由hESC源性中胚層變成心肌細(xì)胞的指定。(a)流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析，其展示在無處理(對(duì)照組)、用BMP4(10ng/ml)或BMP4抑制劑頭蛋白(Noggin) (400ng/ml)處理后，在第4天和第5天時(shí)存在KDR+和TOGFRa+群體，并且在培養(yǎng)第15天時(shí)存在cTnT+表達(dá)。(b)在如上處理的培養(yǎng)物中，在第15天時(shí)每孔的總細(xì)胞數(shù)目。誤差條表示三個(gè)實(shí)驗(yàn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0015]圖3.BMP信號(hào)傳導(dǎo)劑量依賴性地由hESC源性中胚層指定心肌細(xì)胞。流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析的圖形表示，其指示在由用指示量的BMP4或頭蛋白處理的群體產(chǎn)生的第15天培養(yǎng)物中的cTnT+細(xì)胞百分比。NT =無處理。條形表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N=3);*P< 0.05，當(dāng)與無處理相比較時(shí)0.01。
[0016]圖4.心肌和心外膜標(biāo)記物在BMP處理之后的qRT-PCR表達(dá)在由無處理(對(duì)照組)、經(jīng)BMP4處理或經(jīng)頭蛋白(400ng/ml)處理的細(xì)胞產(chǎn)生的群體中，在培養(yǎng)第6、8、10、12和15天時(shí)對(duì)所指示的基因進(jìn)行的基于qRT-PCR的表達(dá)。值是相對(duì)于管家基因TBP。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N=3) ；*P<0.05，當(dāng)與無處理相比較時(shí)**P <0.01。
[0017]圖5.BMP4誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)心外膜標(biāo)記物WTl.B。螢光免疫染色分析，其展示在培養(yǎng)第15天時(shí)，cTnT和WTl在無處理(對(duì)照組)、經(jīng)BMP4(10ng/ml)和頭蛋白(400ng/ml)處理的細(xì)胞中的存在。DAPI染色展示細(xì)胞核
[0018]圖6.WTl+心外膜在傳代后產(chǎn)生上皮細(xì)胞薄層。(a)相位襯度顯微鏡檢查和熒光免疫染色，其展示在培養(yǎng)第15天時(shí)，經(jīng)BMP4(10ng/ml)處理的心外膜細(xì)胞的形態(tài)以及ZOl和WTl的存在。DAPI染色展示細(xì)胞核。比例尺表示ΙΟΟμΜ Jb)相位襯度顯微鏡檢查和熒光免疫染色，其展示在傳代之后4天時(shí)(第15+4天)，經(jīng)BMP4(10ng/ml)處理的心外膜細(xì)胞的形態(tài)以及ZOI和WTI的存在。DAPI染色展示細(xì)胞核。比例尺表示I ΟΟμΜ。
[0019]圖7.對(duì)第15天心肌細(xì)胞、第15天心外膜和傳代后心外膜中細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析。對(duì)在第15天心肌細(xì)胞、第15天心外膜和傳代后4天(第15+4天)心外膜上所指示的標(biāo)記物進(jìn)行的流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析?；疑畛涞闹狈綀D指示未染色的熒光強(qiáng)度。
[0020]圖8.心肌細(xì)胞和心外膜細(xì)胞來源于第4天PDGFRa+中胚層。(a)由第4天EB分離PDGFR+和PDGFR—群體，并且在支持心肌細(xì)胞或WTl+細(xì)胞發(fā)育的條件下接種細(xì)胞。(b)流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析，其展示在于前心原性條件下接種的第15天培養(yǎng)物中的CTnT+細(xì)胞。(c)對(duì)WTl陽性細(xì)胞在前心外膜誘導(dǎo)條件(BMP4)下接種的第15天培養(yǎng)物中的存在進(jìn)行的熒光免疫染色。DAPI染色展示細(xì)胞核。(d)在于前心外膜條件下培養(yǎng)后D15時(shí)，對(duì)在經(jīng)過分選的群體中的心外膜標(biāo)記物WTI和TBX18進(jìn)行的基于qRT-PCR的表達(dá)分析。值是與未分選培養(yǎng)物相比較的倍數(shù)變化。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N= 3); *P < 0.05，未分選培養(yǎng)物#P <0.01。
[0021]圖9.BMP和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞和心外膜細(xì)胞指定。(a)流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析的圖形描繪，其展示在由未經(jīng)處理的細(xì)胞(對(duì)照組)或用BMP4 (10ng/ml)或BMP抑制劑德索莫啡(Dorsomorphin，DM 4μΜ)與指示量的DKKl或CHIR組合處理的細(xì)胞產(chǎn)生的第15天培養(yǎng)物中的cTnT+細(xì)胞百分比。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N = 3); *Ρ
<0.05，當(dāng)在對(duì)BMP路徑進(jìn)行所指示的操控的情形下與‘無Wnt處理’(NT)對(duì)照組相比較時(shí)**?<0.01。(13)在由未經(jīng)處理的細(xì)胞(對(duì)照組)或用81034(101^/1111)或01(4410與指示量的01?或CHIR組合處理的細(xì)胞產(chǎn)生的第15天培養(yǎng)物上，對(duì)WTl表達(dá)進(jìn)行的基于qRT-PCR的分析。值是相對(duì)于管家基因TBP。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N=3);*P<0.05，當(dāng)在對(duì)BMP路徑進(jìn)行所指示的操控的情形下與‘無Wnt處理’(NT)對(duì)照組相比較時(shí)**P<0.01。(c)流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析，其展示在由未經(jīng)處理的細(xì)胞(對(duì)照組)或用BMP4(10ng/ml)或DM(4yM)與指示量的XAV939(XAV)組合處理的細(xì)胞產(chǎn)生的第15天培養(yǎng)物中的cTnT+細(xì)胞百分比和對(duì)WTl表達(dá)的qRT-PCR分析。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N=3);*P< 0.05，當(dāng)在特定BMP處理的情形下與無Wnt處理(參見圖9a和9b)相比較時(shí)**P
<0.01。(d)流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析，其展示在由未經(jīng)處理的細(xì)胞(對(duì)照組)或用BMP4(10ng/ml)或DM(4yM)與指示量的IWP2組合處理的細(xì)胞產(chǎn)生的第15天培養(yǎng)物中的cTnT+細(xì)胞百分比和對(duì)WTl表達(dá)的qRT-PCR分析。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N =3) ;*P < 0.05，當(dāng)在特定BMP處理的情形下與無Wnt處理(參見圖9a和9b)相比較時(shí)林P <0.0l0
[0022]圖10.由仙臺(tái)病毒源性hiPSC和H7hESC產(chǎn)生WTl+心外膜細(xì)胞。(a)熒光免疫染色，其展示W(wǎng)Tl和ZOl在hiPSC源性心外膜培養(yǎng)物中的表達(dá)。DAPI染色展示細(xì)胞核。流程指示操控和分析的時(shí)間安排。(b)熒光免疫染色，其展示W(wǎng)Tl和ZOl在H7 hESC源性心外膜培養(yǎng)物中的表達(dá)。DAPI染色展示細(xì)胞核。流程指示操控和分析的時(shí)間安排。
[0023]圖11.WTl+心外膜細(xì)胞響應(yīng)于TGFm和bFGF處理而進(jìn)行EMT Ja)用于EMT誘導(dǎo)的方案流程。對(duì)第15天WTl+培養(yǎng)物進(jìn)行傳代，允許其靜置I天，并且隨后用TGFm(5ng/ml)處理4天接著無處理(TGFP)，依序用TGFW (5ng/ml)處理4天接著用bFGF (10ng/ml)處理4天(TGFP+bFGF)，或bFGF(10ng/ml)處理8天(bFGF)。培養(yǎng)物無處理充當(dāng)對(duì)照組。(b)在EMT起始后8天時(shí)對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞表面間葉細(xì)胞標(biāo)記物CD90進(jìn)行的流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析?；疑畛涞闹狈綀D指示對(duì)照組培養(yǎng)物熒光強(qiáng)度。(c)在EMT起始之后第2、4、6和8天時(shí)對(duì)心外膜基因WTl和EMT誘導(dǎo)的基因SNAIl和SNAI2進(jìn)行的基于qRT-PCR的表達(dá)。值表示為相對(duì)于實(shí)驗(yàn)匹配的第15天傳代前WTl+培養(yǎng)物的倍數(shù)變化。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N =3)；*P<0.05,與無處理對(duì)照組相比較**P <0.01o
[0024]圖12.WTl和ZOl表達(dá)響應(yīng)于EMT而損失相位襯度和熒光免疫染色，其展示在使用所指示的因子進(jìn)行EMT起始之后8天時(shí)，在心外膜培養(yǎng)物中的細(xì)胞形態(tài)和ZOl和WTl蛋白質(zhì)的表達(dá)。DAPI染色展示細(xì)胞核。
[0025]圖13.EroC通過熒光免疫染色來顯示成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的特征表達(dá)。熒光免疫染色，其展示在使用所指示的因子進(jìn)行EMT起始之后8天時(shí)，處于培養(yǎng)物中的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Smooth muscle actin，SMA)和波形蛋白(Vimentin，VIM)蛋白質(zhì)。DAPI染色展示細(xì)胞核。
[0026]圖14.EPDC通過qRT-PCR來顯示成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的特征表達(dá)。在EMT起始之后8天時(shí)，在所指示的培養(yǎng)物中對(duì)平滑肌基因CCNl、MYH1 UTAGLN和SMTN以及心外膜/心臟成纖維細(xì)胞基因TCF21進(jìn)行的基于qRT-PCR的表達(dá)分析。值表示為相對(duì)于實(shí)驗(yàn)匹配的第15天傳代前WTl+心外膜培養(yǎng)物的倍數(shù)變化。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N=3) ；*P<0.05,與無處理對(duì)照組培養(yǎng)物相比較#P <0.01。
[0027]圖15.hESC心外膜源性平滑肌樣細(xì)胞在受刺激時(shí)產(chǎn)生作用電位。
[0028](a)對(duì)于所指示得處理，測(cè)量EMT誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中主動(dòng)循環(huán)細(xì)胞的總比例。用TGFiHbFGF處理產(chǎn)生響應(yīng)于激動(dòng)劑而具有最大比例主動(dòng)循環(huán)細(xì)胞的群體。條形表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差;N = 3/組；*Ρ〈0.05，由單向方差分析(one-way AN0VA)與圖克事后測(cè)試(Tukey posthoc test)比較時(shí)**P〈0.01。
[0029](b)在如基線處所指示的條件中和在NE和PE添加之后，在主動(dòng)循環(huán)細(xì)胞中的鈣循環(huán)頻率。堆疊條形表示在基線記錄(影線)期間和在NE(白色)或PE(黑色)處理之后對(duì)鈣循環(huán)頻率的貢獻(xiàn)。
[0030](c)在EMT誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中，在NE和PE添加之后的鈣瞬變振幅。無處理NE N = 6個(gè)細(xì)胞，PE ~=4個(gè)細(xì)胞汀6?0肥N=6個(gè)細(xì)胞，PE N= 12個(gè)細(xì)胞汀6印+6?6? NE N= 13個(gè)細(xì)胞，PEN=25個(gè)細(xì)胞。由單向方差分析與圖克事后測(cè)試比較時(shí)*P〈0.05。
[0031](d)在EMT誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中，在NE和PE添加之后的鈣瞬變持續(xù)時(shí)間。無處理NE N=6個(gè)細(xì)胞，PE N = 4個(gè)細(xì)胞;TGF0NE N = 6個(gè)細(xì)胞，PE N= 12個(gè)細(xì)胞汀6印+6?6? NE N=13個(gè)細(xì)胞，PE N=25個(gè)細(xì)胞。由單向方差分析與圖克事后測(cè)試比較時(shí)**P〈0.01。
[0032]圖16.hESC心外膜源性成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞侵入3D凝膠。
[0033](a)在EMT誘導(dǎo)之后D8時(shí)，在基質(zhì)膠侵入分析的XY平面(俯視圖)和3D重構(gòu)(側(cè)視圖)中的代表性視野。
[0034](b)在EMT起始后D8時(shí)的最大基質(zhì)膠侵入深度。條形表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(N=3);如由斯圖登氏T檢驗(yàn)(Student’s T-test)所分析，與未處理對(duì)照組相比較#P <0.01。
[0035]圖17.WTl+心外膜細(xì)胞在傳代后上調(diào)ALDH1A2表達(dá)并且顯示醛脫氫酶活性。(a)在D15WT+心外膜培養(yǎng)物和傳代后第15+8天未處理心外膜培養(yǎng)物中對(duì)ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3進(jìn)行的基于qRT-PCR的表達(dá)分析。值是相對(duì)于管家基因TBP。誤差條表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(N= 3) ；*P<0.05,與ALDH1A2表達(dá)水平相比較#P <0.01。
(b)在EMT起始后