CRISPR-Cas9特異性敲除豬FGL2基因的方法及用于特異性靶向FGL2基因的sgRNA的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因工程技術領域，尤其設及基因敲除技術領域，具體設及 CRISPR-化s9特異性敲除豬FGL2基因的方法及用于特異性祀向FGL2基因的sgRNA。
【背景技術】
[0002] 器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬的 患者通過器官移植而延續(xù)生命。隨著人口老齡化及醫(yī)療技術的進步，需要進行器官移植手 術的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴重制約了器官移植手術的開展。W腎臟移植為例， 我國每年需要進行腎移植的患者多達30萬，而可用于移植的捐獻腎臟不超過1萬例，大部 分患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其 他物種，W提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。
[0003] 目前，根據(jù)生物安全性、生理功能指標、經(jīng)濟性及稀有物種保護等多方面評價，豬 成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到 人會產(chǎn)生強烈的免疫排斥反應。因此，通過基因工程對豬進行改造，W產(chǎn)生適合于人體移植 的器官，成為異種移植的終極目標。
[0004] Fibrinogen-like protein 2 (FGL2)具有高度保守的纖維蛋白原結構域，它既可 W表達在細胞膜表面也可W被分泌到細胞外，膜表面的FGL2是一個直接的凝血酶原酶，而 分泌到胞外的FGL2具有免疫調(diào)節(jié)作用。在缺少經(jīng)典的凝血酶原酶復合體的情況下，F(xiàn)GL2促 進促凝血酶向凝血酶的轉(zhuǎn)化。纖維素沉積是AVR的一種典型特征。利用抗體中和或者FGL2 敲除的小鼠，F(xiàn)GL2的缺失會抑制纖維素的沉積。凝血酶是一個潛在的免疫激活因子，它可 W激活血小板，并且直接作用于血管平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞，而血管內(nèi)皮細胞的激活 會促進血栓的形成。在小鼠到大鼠的異種屯、臟移植模型中，作為供體的FGL2缺失的小鼠的 確降低了 AVR的產(chǎn)生。既然FGL2對于AVR有如此重要的作用，那么構建FGL2缺失的基因 修飾豬，將很有可能對異種移植作出重要貢獻。
[0005] 目前，常見的基因敲除技術包括同源重組化omologus Recombination, HR)技術、 類轉(zhuǎn)錄激活效應子核酸酶（Transcription Activator-Uke Effector Nuclease, TALEN) 技術、鋒指核酸酶狂inc-Finger Nuclease, ZFN)技術W及最近發(fā)展的規(guī)律成簇間隔短回 文重復（Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic R巧eat, CRISPR)技術。 皿技術由于重組效率低下（效率大約只有10 6)，對突變體的篩選工作非常耗時和低效，已 逐漸被取代。TALEN技術和ZFN技術的切割效率一般能達到20%，但都需要構建可W識別 特定序列的蛋白質(zhì)模塊，前期工作繁瑣費時。ZFN技術的模塊設計較為復雜且有較高的脫祀 率，其應用有限。
[0006] CRISIS是一種源于原核生物的后天免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)執(zhí)行干擾功能的復合物由蛋 白質(zhì)Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)有Ξ種類型，其中第二類化s9 系統(tǒng)組成簡單，已被積極應用于基因工程領域。化s9祀向切割DM是通過兩種小RNA-一 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)與祀序列互補識別的原理實現(xiàn) 的?，F(xiàn)在已經(jīng)將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guide RNA)，能夠識別 特定的基因序列，引導化s9蛋白進行切割。在真核生物中，DNA被切斷后發(fā)生非同源重組 末端連接，造成移碼突變，最終導致基因功能性敲除。
[0007] 相比于上述3種技術，CRISPR技術操作簡單、篩選效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)精確的祀向切 害d。因此，通過CRISPR技術敲除FGL2基因能夠極大地提高FGL2缺失細胞及基因工程豬的 篩選效率。但是該路徑的關鍵技術難題是設計并制備精確祀向的sgRNA，因為基因的祀向精 確度高度依賴于sgRNA祀序列，能否成功設計出精確祀向的sgRNA成為敲除目的基因的關 鍵技術問題，本發(fā)明意在解決該技術問題從而為敲除FGL2基因提供堅實的基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供CRISPR-化s9特異性敲除豬FGL2基因的方法及用于特異 性祀向FGL2基因的SgRNA。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供在CRISPR-化s9特異性敲除豬FGL2基因中用 于特異性祀向FGL2基因的SgRNA,該SgRNA具有W下特點：
[0010] (1)該SgRNA在FGL2基因上的祀序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列規(guī)則，其 中N(20)表示20個連續(xù)的堿基，其中每個N表示A或T或C或G，符合規(guī)則的祀序列可W位 于正義鏈或反義鏈；
[0011] 似該SgRNA在FGL2基因上的祀序列位于FGL2基因的外顯子編碼區(qū)；
[001引 （3)該SgRNA在FGL2基因上的祀序列是唯一的。
[0013] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :1~78中任一條序列 所示的序列。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述祀序列為序列表中SEQ ID NO :3或25所示的序列。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供CRISPR-化s9特異性敲除豬FGL2基因的方 法，該方法包括如下步驟：
[0016] (1)在第一方面所述的SgRNA的祀序列的5'-端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核巧酸序列；在第一方面所述的SgRNA的祀序列對應的互補序列的兩端加 上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸 序列與反向寡核巧酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0017] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入線性化的攜帶化s9基因的表達載體，得到攜帶含 相應祀序列的SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，篩選鑒定出正 確的陽性克隆，并對陽性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；
[001引 （3)用上述攜帶有SgRNA寡聚核巧酸和化s9基因的表達載體、包裝質(zhì)粒和包裝細 胞系包裝出同時攜帶祀向FGL2基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[0019] (4)使用上述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養(yǎng)；然后收集被感染的目的 細胞，W其基因組DNA為模板擴增包含上述祀序列的基因片段，經(jīng)過變性、復性及酶切，確 定FGL2基因的敲除情況。
[0020] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述表達載體為序列表中SEQ ID NO :79所示序列的載 體。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述方法包括如下步驟：
[002引 （1)在第一方面所述的sgRNA的祀序列的5'-端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核巧酸序列；在第一方面所述的sgRNA的祀序列對應的互補序列的5'-端加上AAAC序 列、3'-端加上C，合成得到反向寡核巧酸序列；將合成的正向寡核巧酸序列與反向寡核巧 酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核巧酸；
[0023] (2)將上述雙鏈寡聚核巧酸連入如序列表中SEQ ID NO :79所示序列的表達載體 lentiCRISPR v2經(jīng)BsmB I限制性內(nèi)切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶SgRNA寡聚核巧 酸的重組表達載體lentiCRISPR V2-FGL2,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆， 并對陽性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；
[0024] (3)用上述表達載體lentiCRISPR V2-FGL2、包裝質(zhì)粒和包裝細胞系包裝出同時攜 帶祀向FGL2基因的SgRNA和化s9的假型慢病毒；
[002引（4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養(yǎng)；然后收集被感染 的目的細胞，W其基因組DNA為模板擴增包含上述祀序列的基因片段，經(jīng)過變性、復性及酶 切，確定FGL2基因的敲除情況。
[0026] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述包裝質(zhì)粒為質(zhì)粒pLPl、質(zhì)粒pLP2和質(zhì)粒pLP/VSVG ; 上述包裝細胞系為肥K293T細胞。
[0027] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述目的細胞為豬PIEC細胞。
[002引作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述W其基因組DNA為模板擴增包含上述祀序列的基因 片段，經(jīng)過變性、復性及酶切，確定FGL2基因的敲除情況，具體為：
[0029] (a) W感染病毒的目的細胞的基因組DNA為模板，用FGL2基因的上下游引物擴增 包含上述SgRNA的祀序列的FGL2基因片段，同時用相同引物擴增未感染病毒的野生型細胞 的基因組DNA ;
[0030] 化）純化上述擴增到的FGL2基因片段，然后將來自感染病毒的目的細胞的FGL2基 因片段與來自野生型細胞的FGL2基因片段等量混合，加熱變性、復性，形成雜交DNA分子；
[0031] (C)用化uiser酶切割復性后的雜交DNA分子；
[003引 （d)電泳檢測酶切產(chǎn)物，檢測祀序列介導的FGL2基因敲除效果。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的第Ξ方面，本發(fā)明提供在CRISPR-化s9特異性敲除豬FGL2基因的方 法中用到的重組表達載體lentiC