尿液中的hpv檢測的制作方法
【專利說明】尿液中的HPV檢測
[0001] 本公開內容領域
[0002] 本公開內容設及基于分子技術的醫(yī)學和臨床診斷的領域。該技術包括用于檢測來 自人受試者的尿液樣品中人乳頭瘤病毒化PV)核酸分子作為受試者中HPV感染的指示物的 方法。該檢測方法包括HPV感染的類型特異性檢測和HPV基因型的檢測。
[0003] 本公開內容的背景
[0004] 就在最近的2011年，通過使用尿液樣品的人乳頭瘤病毒化PV)感染的檢測包括了 對可溶性PCR抑制劑在尿液中存在的關注(參見Bissett等的第1745頁右欄）。該關注導致 Bissett等測試了 Ξ種不同的用于處理尿液樣品的方案作為HPV核酸提取的一部分。被報道 為在Ξ種當中具有較好的靈敏度的一個方案是，Wl3,000rpm離屯、尿液（lml)20分鐘，去除 所得的上清液，在30化1中重懸，然后在-25°C冷凍直到用于核酸提取。其他兩種方案是，在-25°C儲存未處理的尿液，隨著i)在解凍之后離屯、和重懸（并然后立即用于核酸提?。籛及 ii)在解凍之后不處理(并直接用于核酸提?。?br>[000引相比于未分級的尿液，Bissett等報道的細胞團塊(cellular pel let)中的較高靈 敏度與多名研究人員如Vorsters等在2012年W及Enerly等在2013年綜述的使用細胞團塊 一致。Vorsters等指出的兩個例外是，Strauss等，其等報道了通過離屯、為上清液和重懸在 較小體積上清液中的細胞團塊對尿液分級，W及Smits等，其報道了如由Boom等所描述的通 過硫氯酸脈(guanidinium thiocianate)裂解和分離來提取男性尿液。使用稀釋減少或消 除PCR抑制劑的影響被Strauss等明確指出（參見第538頁；LStrauss等還報道了通過濃縮細 胞團塊通過用尿液上清液重懸形成的級分(fraction)中58.4%的峰值靈敏度(參見第540 頁)。
[0006] 本文對文獻的引用不應被解釋為反映對任一文獻是相關的現(xiàn)有技術的承認。此 夕h它們的引用不指示對相關公開內容的檢索。關于運些文獻的日期或內容的所有敘述基 于可獲得的信息而不是對其準確性或正確性的承認。
[0007] 本公開內容簡述
[0008] 本公開內容設及用于檢測來自人受試者的尿液樣品中的人乳頭瘤病毒化PV)核酸 分子的方法。所公開的方法不將尿液分級為無細胞級分和含細胞級分，或可溶性級分和不 溶性級分，并且令人驚訝地提供了比對于細胞團塊報道的靈敏度更高的靈敏度。不分級允 許從尿液制備核酸而不產生因分離技術導致的分子損失。甚至在制備和檢測HPV核酸之前 解凍的冷凍樣品的情況下觀察到來自未分級的尿液的令人驚訝的靈敏度。
[0009] 在第一方面，本公開內容包括通過使用來自人受試者的尿液樣品檢測人乳頭瘤病 毒化PV)感染的方法。樣品可來自女性或男性受試者，任選地調整所述檢測W適應所觀察到 的HPV感染的類型或者本領域技術人員已知的針對女性受試者或男性受試者的HPV感染的 類型。
[0010] 所公開的方法包括從收集自人受試者的尿液樣品中分離或制備核酸。尿液樣品在 分離或制備之前是未分級的。因此，不存在將尿液樣品處理為含細胞級分和無細胞級分，或 可溶性級分和不溶性級分。且尿液樣品包含如人類受試者的尿液中存在的無細胞HPV核酸、 HPV病毒粒子或病毒顆粒，W及細胞締合的HPV核酸。
[0011] 在一些實施方案中，尿液樣品被處理W減少核酸降解。處理可在收集之后且在樣 品被進一步處理、操作或儲存之前。在其他實施方案中，處理可在收集W及進一步處理、操 作或儲存之后但在提取、分離或制備樣品中的核酸分子之前。處理的非限制性實例包括冷 凍樣品、降低樣品的溫度、熱滅活樣品中的核酸酶、增加 pH、添加減少降解的試劑，或本領域 技術人員已知的運些技術的組合。在某些情況下，所添加的試劑增加 pH、增加鹽濃度或離子 強度;或者所添加的試劑是乙二胺四乙酸化DTA)，鹽酸脈異硫氯酸脈(G 口 C)或其他離液鹽， N-月桂酷肌氨酸，W及十二烷基硫酸鋼。如本文描述的任何處理產生被處理的尿液樣品，從 該被處理的尿液樣品可如下所述地制備核酸。
[0012] HPV核酸的分離或制備在外源或添加的核酸載體試劑的存在下來進行。載體試劑 可W是技術人員已知的用于改進核酸的分離而不干擾隨后的分離步驟的任何載體試劑。非 限制性實例包括載體RNA、載體DNA、線性聚丙締酷胺(LPA)和糖原。
[0013] 分離的HPV核酸可通過技術人員已知的手段來檢測。在一些實施方案中，檢測可包 括一個或更多個HPV序列的擴增。在一些情況下，擴增可包括使用正向和反向引物的聚合酶 鏈式反應(PCR)。引物之一或二者可包括非HPV序列和/或可檢測的標記。在其他實施方案 中，檢測可包括擴增，隨后是對所擴增的分子測序。在另外的實施方案中，檢測可包括直接 測序核酸而無需事先擴增。在另外的可選實施方案中，檢測包括選自作為非限制性實例的 W下技術:核酸雜交;循環(huán)探針反應;單鏈構象多態(tài)性(SSCP);鏈置換擴增(STA);W及限制 性片段長度多態(tài)性(RFLP)。
[0014] 檢測到尿液樣品中的HPV核酸序列指示HPV核酸分子在樣品的尿液來源中的存在。 核酸分子可呈W下形式:無細胞核酸、HPV病毒粒子或HPV病毒顆粒、細胞締合的核酸，諸如 細胞內的HPV核酸分子或與細胞的外表面締合的HPV核酸分子，或W上的任何組合。在細胞 內的HPV核酸分子的一個非限制性實例是在細胞內的一個或更多個游離(episomal)拷貝的 HPV基因材料。另外，檢測到尿液樣品中的HPV核酸分子指示HPV感染在受試者中的存在。在 一些實施方案中，感染可W是對于泌尿道中的細胞的。在其他實施方案中，感染可W是對于 來自泌尿道外的細胞的，作為非限制性的實例諸如宮頸細胞。
[001引被檢測的HPV可W是單一類型的，作為非限制性的實例諸如HPV16或18?？蛇x地，檢 測可W是兩種或更多種類型的，諸如HPV 16和18,或HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59和68。在一些情況下，檢測可W是至少一個"高風險"的HPV類型和至少一個"低風險" 的HPV類型的。因此，檢測包括檢測任何一種或更多種HPV類型。
[0016] 在一些實施方案中，方法可W包括(a)從自人受試者收集的未分級的尿液樣品中 并在外源或添加的核酸載體試劑的存在下，從所述樣品分離HPV核酸，W及(b)檢測所分離 的HPV核酸。在一些情況下，檢測的HPV核酸的存在可用來指示HPV感染在受試者中的存在。 分離可包括去除非核酸或非DNA細胞組分，諸如不與核酸締合的蛋白和脂質。
[0017] 在第二方面，本公開內容包括了制備存在于來自人受試者的尿液樣品中的HPV核 酸的方法。所公開的方法可包括按本文描述的從收集自人受試者的未分級的尿液樣品分離 或制備核酸。所得核酸可技術人員已知的任何適合的方式被測定、測試或使用。所得的 核酸是如存在于人類受試者的尿液中的無細胞HPV核酸、來自HPV病毒粒子或病毒顆粒，或 來自細胞締合的HPV核酸。如本文所述的，尿液樣品任選地被處理W減少核酸降解。另外，如 本文描述的，HPV核酸的分離或制備在外源或添加的核酸載體試劑的存在下來進行。
[0018] 在一些實施方案中，方法可W包括從自人受試者收集的未分級的尿液樣品中并在 外源或添加的核酸載體試劑的存在下，分離所述樣品中的核酸。分離可包括去除非核酸或 非DNA細胞組分，作為非限制性的實例諸如蛋白和脂質(且包括不與核酸締合的那些）。所得 的分離的材料是包括HPV核酸分子和非HPV核酸分子(諸如來自受試者的細胞基因組的那 些)兩者的組合物。分離的HPV核酸可W是單一類型的，作為非限制性的實例諸如HPV 16或 18?？蛇x地，核酸可W是兩種或更多種類型的，諸如HPV16和18,或HPV 16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59和68。在一些情況下，核酸可^是至少一個"高風險"的冊￥類型和至少 一個"低風險"的HPV類型的。
[0019] 在另外的方面，本公開內容包括運樣的組合物，其包含通過所公開的方法分離或 制備的HPV核酸。所述組合物包含減少的量的蛋白質W及最初與HPV核酸一起存在于尿液樣 品中的其他生物組分或細胞組分。減少蛋白質W及其他生物組分或細胞組分可通過本文描 述的任何方法。所述組合物可包含與適合的緩沖劑和/或馨合劑組合的核酸。
[0020] 本公開內容還提供了用于檢測HPV的診斷試劑盒，所述試劑盒包括:進行全部或部 分本文公開的方法的試劑。
[0021 ] 附圖簡述
[0022] 圖1示出了來自感染了 HPV-16(上圖）和HPV-54(下圖）的人受試者的尿液樣品的毛 細管電泳分析的代表性結果。所指示的堿基對(〇、20、40、60、80、100和120)反映了使用如本 文公開的一組高風險化R)引物的PCR反應檢測到的核酸分子的長度。深色蹤跡是樣品蹤跡， 而深色蹤跡是分子量標志物。Y軸刻度指示從0至10,000的相對巧光單位。
[0023] 圖2示出了來自未感染的（陰性對照）人受試者和分別感染了HPV-16、HPV-18和 HPV-81的人受試者的尿液樣品的毛細管電泳分析的代表性結果。所指示的堿基對(0、20、 40、60、80、100和120)反映了通過使用與圖1中相同的高風險化3)引物的?〔巧廣增檢測到的 HPV分子的長度。陰影區(qū)域指示93-9化P的范圍。Y軸刻度指示從0至10,000的相對巧光單位。
[0024] 實踐本公開內容的方式的詳述
[0025] 遮述
[0026] 人乳頭瘤病毒化PV)是與皮膚和粘膜上皮的良性和惡性病變相關的親上皮細胞病 毒(邱itheliotropic viruses)。存在對HPV感染與宮頸癌的后續(xù)發(fā)展之間的因果關系的充 分證實。還存在將HPV感染與頭部和頸部、呼吸組織和乳腺的癌癥相關的觀察結果。 (Braakhuis等，2004 , J.化tl. Cancer Inst. 96(13): 998-1006 ; Dahlstrand等，2004 , Anticancer Res.24(3b): 1829-35;Daling等，2004,(Mincer 101(2) :270-80;Ha等，2004, Grit.Rev.Oral Biol.Med.15(4):188-96;化fkam