一種FAPa激活式腫瘤診斷多肽磁珠復(fù)合物的制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有腫瘤診斷意義的多肽磁珠復(fù) 合物FAM-GP-NWs的制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 有關(guān)尋找生物標(biāo)志物的研究是為了能夠鑒別出可靠的指標(biāo)來對疾病進行風(fēng)險評 估，早期診斷，設(shè)計對病人的治療方案以及對復(fù)發(fā)性疾病進行有效監(jiān)測。迄今為止，廣泛的 生物分子如細(xì)胞代謝產(chǎn)物，多肽，蛋白質(zhì)，無細(xì)胞核酸，外來分子等已經(jīng)發(fā)展成不同形式的 生物標(biāo)志物。然而，由于生物標(biāo)志物在體循環(huán)中的濃度非常低，在體液中很難溶解并且在體 內(nèi)和體外都很會迅速降解，以天然存在的生物標(biāo)記物來診斷疾病受到了檢測技術(shù)和生物學(xué) 的限制。另一種內(nèi)源性生物標(biāo)志物是通過系統(tǒng)的給予外源性藥物來檢測的機體的生物狀 態(tài)。這些方法提示我們可以利用機體的生理學(xué)行為或干擾疾病特異性的分子過程來研究特 定藥物作為疾病診斷的替代指標(biāo)的可能性。
[0003] 我們設(shè)計了一種人工合成的納米級的試劑，它們在體循環(huán)中可以通過組織器官或 者疾病特異性的血管空隙來聚集到患病組織，到達疾病環(huán)境后，它們被異?；钚缘牡鞍酌?水解，釋放出表面上連接的帶有熒光分子的多肽底物到宿主尿液中，作為合成的生物標(biāo)志 物通過ELISA或者質(zhì)譜來鑒定和檢測。由于過表達的蛋白酶與很多疾病如癌癥、血栓、炎癥、 動脈粥樣硬化等關(guān)系密切，所以對這些失調(diào)蛋白酶的多路監(jiān)控為判斷疾病狀態(tài)和分期提供 了可能。受到腎小球選擇性濾過方式的啟發(fā)，我們設(shè)計了一種蛋白酶敏感的納米片段我們 稱之為人工合成生物標(biāo)志物FAM-GP-磁珠(FAM-GP-NWs)，將納米磁珠用熒光集團標(biāo)記的蛋 白酶底物所修飾，通過腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞過表達的蛋白酶FAPa的水解作用，信號被釋放 到血液循環(huán)中然后集中到宿主尿液當(dāng)中接受檢測，我們利用FAPa陽性腫瘤模型，檢測尿液 中信號強度，探討這種人工合成尿生物標(biāo)志物是否能作為一種有效的進行癌癥早起診斷的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞激活蛋白（FAPa)激活式腫瘤診斷 多肽磁珠復(fù)合物的制備及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：提供一種酶激活式腫瘤診斷用多肽磁珠復(fù)合物，其結(jié) 構(gòu)式如（I)所示:X-SM(PEG)2-Y(I)，其中:X代表一種被生物素(Biotin)標(biāo)記的帶有FAM基團 的FAPa酶切底物多肽，其結(jié)構(gòu)式為Biotin-DGlu-G-DVal-DAsn-DAsp-DAsn-DGlu-DGlu-G- DPhe-DPhe-DSer-DAla-DArg-Lys(5FAM)-GPGPNQC，其中D代表氨基酸類型為D型;Y代表平均粒 徑100nm的氨基磁珠，SM(PEG)2代表MHS-(PEG)2-Maleimide連接子，減少X與Y之間的相互干 擾。
[0006] 作為本發(fā)明的進一步改進，X的基序N端的GPGP氨基酸是FAPa的酶切底物GP序列的 串聯(lián)子，F(xiàn)APa能夠水解P氨基酸N端酰胺鍵。
[0007]本發(fā)明以FAPa為革El標(biāo)，成功設(shè)計并合成了被Biotin標(biāo)記并攜帶有FAM基團的FAPa 激活式多肽底物，并以氨基納米磁珠為載體，以SM(PEG) 2為連接子，成功合成了 FAPa激活式 腫瘤診斷多肽磁珠復(fù)合物，從而實現(xiàn)對腫瘤的診斷，并且對機體不產(chǎn)生傷害，對類似的診斷 試劑的設(shè)計研究具有參考意義。
[0008] 本發(fā)明多肽的制備方法采用固相多肽合成法。。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是:體內(nèi)實驗證明，該酶激活式腫瘤診斷納米磁珠復(fù)合物能夠 被FAPa特異性酶切，釋放熒光多肽信號至尿液并被檢測到，實現(xiàn)了對腫瘤的診斷的目地，而 對正常組織無毒無害。
[0010] 同時本發(fā)明研究的制備方法方便易行，具有良好的醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用推廣價值。
【附圖說明】
[0011] 圖1是FAM-GP-NWS結(jié)構(gòu)及作用原理；
[0012]圖2是含有Biotin及FAM基團的底物多肽的MS與HPLC分析圖；
[0013] 圖3是FAM-GP-NWs結(jié)構(gòu)、合成與鑒定；
[0014] 圖4是FAM-GP-NWs的熒光鑒定與體外酶切效率檢測
[0015] 圖5是小動物成像系統(tǒng)檢測FAM-GP-磁珠在小鼠體內(nèi)的熒光分布及循環(huán)過程。
【具體實施方式】
[0016] 下述實驗中所使用的多肽底物序列如下：
[0017] Biotin-DGlu-G-DVal-DAsn-DAsp-DAsn-DGlu-DGlu-G-DPhe-DPhe-DSer-DAla-DArg-Lys(5FAM)-GPGPNQC；
[0018] 數(shù)據(jù)分析:計數(shù)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行分析，采用Levene法對各組計數(shù) 結(jié)果進行方差齊性檢驗。如果各組方差齊性(P>〇.05時，方差齊性），然后采用獨立樣本t檢 驗，分析組間是否有顯著差異(P<〇.05時，有顯著差異）
[0019] 實施案例l:FAPa特異性底物的合成
[0020] 1 ·將2-Chlorotrityl Chloride Resin樹脂放入反應(yīng)管中，加 DCM(15ml/g)，振蕩 30min；
[0021] 2.通過沙芯抽濾掉溶劑，加入3倍摩爾過量的Fmoc-L-Cys(Trt)-〇H，再加入10倍摩 爾過量的DIEA，最后加入DMF溶解，振蕩30min，甲醇封頭，30min;
[0022] 3.去掉溶劑，加20 %哌啶/DMF溶液（15ml/g)，5min，去掉再加20 %哌啶/DMF溶液 (15ml/g)，15min;
[0023] 4.抽掉哌啶溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一 滴，105°C_110°C加熱5min，變深藍(lán)色為陽性反應(yīng)；
[0024] 5.DMF(10ml/g)兩次，甲醇（10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次；
[0025] 6.護氨基酸Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH三倍過量，HBTU三倍過量，均用盡量少DMF溶解， 加入反應(yīng)管，立刻加入DIEA十倍過量，反應(yīng)30min;
[0026] 7 .抽掉溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴， 105°C_110°C加熱5min，無色為陰性反應(yīng)，說明反應(yīng)完全；
[0027] 8 · DMF( 10ml/g)-次，甲醇（10ml/g)兩次，DMF( 10ml/g)兩次；
[0028] 9.重復(fù)三至八步操作，依次連接序列中剩余氨基酸，直至最后一個，脫除最后一個 氨基酸的Fmoc保護基；
[0029] 10 · DMF( 10ml/g)兩次，甲醇（10ml/g)三次，DCM( 10ml/g)三次，抽干樹脂；
[0030] 11.配制切割液（10/g)TFA 94.5%;水 1%;EDT 2.5%;TIS 2.5%，切割時間： 120min；
[0031] 12.將裂解液用氮氣盡量吹干，用乙醚洗六次，然后常溫?fù)]干；
[0032] 13.用HPLC純化多肽，將純化后的溶液凍干，既得到成品；
[0033] 14.分別取少量的成品多肽，做MS的分子量鑒定，和HPLC分析的純度鑒定（圖2);
[0034] 15.將白色粉末狀的多肽，密封包裝，-20度保存；
[0035]其余多肽的合成同上述方法。
[0036] FAM-GP-NWs 的合成
[0037] (1)按照SM(PEG) 2與活化后的納米磁珠氨基數(shù)摩爾比約50 :1混合于10ml EP中 (pH7.4，5mM EDTA)，氮氣保護下于搖床中室溫結(jié)合過夜，產(chǎn)物用roS清洗，磁力架分離后備 用；
[0038] (2)將多肽底物溶解于roS與第一步產(chǎn)物常溫反應(yīng)過夜（摩爾比l:l，pH 7.4,5mM EDTA，氮氣保護），用磁力架分離帶有磁性的產(chǎn)物，用適量PBS清洗后將產(chǎn)物溶解，-20°C保 存。
[0039] 實施案例2:FAM-GP-NWs的腫瘤診斷效果研究
[0040] 體外腫瘤診斷效果驗證：
[0041 ]根據(jù)目地多肽對表達不同分子標(biāo)志物的細(xì)胞生長的抑制作用，能夠直接反應(yīng)FAP-GP-NWs的體外腫瘤診斷活性。因此，我們首先通過檢測不同細(xì)胞株的分子標(biāo)志物的表達量 來選擇合適的細(xì)胞株，然后通過ELISA實驗檢測FAP-GP-NWs的腫瘤診斷意義。具體操作如 下：
[0042]細(xì)胞株的選擇：
[0043] 我們選擇了FAPa+的L929細(xì)胞株及FAPa-的4T1細(xì)胞株，并用Western-bolt檢測了 FAPa的表達量。
[0044] 蛋白免疫印跡(Western Blot):
[0045]