使用改進(jìn)的溶劑-清潔劑方法進(jìn)行病毒滅活的制作方法
【專利說明】
[0001] Μ ·費(fèi)爾根豪爾、Μ ·法爾西特、D ·米松、F ·蒙唐東
[0002] 本申請是申請日為2011年12月14日、申請?zhí)枮?01180067642.8(國際申請?zhí)枮?PCT/US2011/064960)、名稱為"使用改進(jìn)的溶劑-清潔劑方法進(jìn)行病毒滅活"的發(fā)明專利申 請的分案申請。
[0003] 優(yōu)先權(quán)要求
[0004]本專利申請依據(jù)美國法典第35章第§119(e)條要求于2010年12月15日申請的美國 臨時專利申請系列號No. 61/423，512的優(yōu)先權(quán)，在此通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本申請說明書涉及在蛋白質(zhì)制造期間滅活病毒污染物的方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 作為治療許多影響個體健康的疾病、紊亂、或狀況的方法，使用包含治療性蛋白質(zhì) 的藥物組合物的重要性一直在提高。許多在藥物組合物中使用的蛋白質(zhì)典型地是通過使用 哺乳動物細(xì)胞系進(jìn)行重組體生產(chǎn)、或者通過從生物液體中提純而獲得的。然而，通過這些方 法制造的治療性蛋白質(zhì)可能會被對個體健康有害的傳染性病原病毒污染。因此，重要的是 加工治療性蛋白質(zhì)以便消除任何污染性病毒的活性、借此確保得到的藥物組合物給藥于個 體是安全的。
[0007] 當(dāng)前有許多不同的用于滅活傳染性病原病毒的方法，包括，例如加熱滅活、溶劑/ 清潔劑(S/D)滅活、pH滅活、化合物滅活、和/或紫外線照射滅活。在這些方法中，S/D滅活或 許是最為廣泛接受的殺病毒方法，因?yàn)閹缀跛兄匾娜祟惒≡w都是包膜病毒，其對于 通過溶劑和清潔劑破裂細(xì)胞膜是敏感的。另外，當(dāng)與其他的殺病毒方法相比時，S/D方法可 更好地保持被治療的液體的含量和生物活性。例如，采用加熱、酸性pH、化合物和輻射的滅 活方法存在一些問題，因?yàn)檫@些試劑是刺激性的和/或侵襲性的，并且傾向于使待純化的治 療性蛋白質(zhì)變性、或者另外失去活性。
[0008] 在S/D滅活方法中，將有機(jī)溶劑和清潔劑與包括被純化蛋白質(zhì)的液體混合，并且保 溫。該溶劑可產(chǎn)生促進(jìn)在清潔劑和包封病毒的類脂膜之間聚集的環(huán)境，并且清潔劑可破壞 在該類脂膜中分子之間的相互作用。一旦被破壞，包膜病毒就不再能結(jié)合并感染細(xì)胞，并且 不能再生，因?yàn)橥暾念愔@些活性而言是必不可少的。該滅活一般在超過20°C的溫 度下進(jìn)行，因?yàn)檩^高的溫度可促進(jìn)包膜的破裂。例如，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)指南使用的 典型狀況是0.3%磷酸三(正丁)酯(TNBP)和1%聚山梨酸酯80單油酸山梨醇酐酯（吐溫? 80) 在24°C下保溫至少6小時、或者0·3%ΤΝΒΡ和1%聚氧乙烯辛基苯基醚(TRITON(曲通）?X-100)在24°C下保溫至少4小時。參見，例如，WHO技術(shù)報告，附錄4, "病毒滅活和去除工序以便 保障人類血漿產(chǎn)物的病毒安全性"指南，檔案號924,第151-224頁，（2004)。
[0009] 溶劑/清潔劑混合物保溫至超過20°C的溫度具有幾個缺陷。首先，在較高的溫度下 滅活是費(fèi)時的，因?yàn)轭A(yù)熱混合物至溫度高于20°C會增加給總加工時間大約2至大約6個小 時。其次，在該較高的溫度下保溫、連同促進(jìn)均勻加熱所必需的攪拌會增強(qiáng)蛋白質(zhì)聚集形 成，導(dǎo)致有用的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率和/或活性下降。暴露于高于20°C的溫度也會增加蛋白質(zhì)對降 解的敏感性。本申請說明書公開了一種新穎的用于滅活來自樣品的傳染性病原病毒的S/D 方法，其可克服這些缺陷。在此公開的方法使用低于兩個小時的保溫時間，并且保溫溫度低 于20°C。減少保溫時間可減少加工和/或制造蛋白質(zhì)所必需的總體時間，所述蛋白質(zhì)是通過 重組體生產(chǎn)或者生物液體提純而獲得的。另外，減少時間并且降低溫度可通過降低蛋白質(zhì) 對聚集和降解的敏感性而導(dǎo)致提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 因此，本申請說明書的一些方面公開了滅活含有脂質(zhì)外套的病毒的方法，該方法 包括下述步驟:a)提供包含具有活性的蛋白質(zhì)的液體;b)將有機(jī)溶劑和表面活性劑與該液 體相混合，借此產(chǎn)生混合物；以及c)將該混合物保溫至多大約120分鐘;其中兩個步驟(b)和 (c)在不高于大約20°C的溫度下進(jìn)行；其中混合物在保溫后基本上不含活的含有脂質(zhì)外套 的病毒;并且其中所述蛋白質(zhì)在保溫后的活性為步驟(a)中所提供活性的至少25%。該液體 可能是細(xì)胞裂解液、細(xì)胞上清液、來自在前提純步驟的洗脫液、或者生物液體。該蛋白質(zhì)可 以通過使用細(xì)胞系進(jìn)行重組體生產(chǎn)、或者通過從生物液體中提純而得到。有機(jī)溶劑可以是 醚、醇、或者烷基磷酸酯比如磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯。表面活性劑可以是離子型表面 活性劑比如陰離子表面活性劑或者陽離子表面活性劑、兩性離子型(兩性)表面活性劑、或 者非離子型表面活性劑。該方法可以、或者可以不進(jìn)一步包括在步驟( c)之后從混合物中除 去溶劑、表面活性劑和/或非存活病毒的步驟。
[0011] 本申請說明書的其他方面公開了一種基本上不含含有脂質(zhì)外套的病毒的蛋白質(zhì)， 其由包括下述步驟的方法獲得:a)提供包含具有活性的蛋白質(zhì)的液體;b)將有機(jī)溶劑和表 面活性劑與該液體相混合，借此產(chǎn)生混合物；以及c)將該混合物保溫至多大約120分鐘；其 中兩個步驟(b)和(c)在不高于大約20°C的溫度下進(jìn)行;其中混合物在保溫后基本上不含活 的含有脂質(zhì)外套的病毒；以及其中所述蛋白質(zhì)在保溫后的活性為步驟(a)中所提供活性的 至少25 %。
[0012] 本申請說明書的其他方面公開了滅活含有脂質(zhì)外套的病毒的方法，該方法包括下 述步驟:a)提供一種包含具有活性的因子VIII的液體;b)將有機(jī)溶劑和表面活性劑與該液 體相混合，借此產(chǎn)生混合物；以及c)將該混合物保溫至多大約120分鐘;其中兩個步驟(b)和 (c)在不高于大約20°C的溫度下進(jìn)行；其中混合物在保溫后基本上不含活的含有脂質(zhì)外套 的病毒;并且其中因子VIII在保溫后的活性為步驟(a)中所提供活性的至少25%。
[0013] 本申請說明書的其他方面公開了一種基本上不含含有脂質(zhì)外套的病毒的因子 VIII，其由包括下述步驟的方法獲得:a)獲得包含具有活性的因子VIII的液體;b)將有機(jī)溶 劑和表面活性劑與該液體相混合，借此產(chǎn)生混合物；以及c)將該混合物保溫至多大約120分 鐘；其中兩個步驟(b)和（c)在不高于大約20°C的溫度下進(jìn)行；其中混合物在保溫后基本上 不含活的含有脂質(zhì)外套的病毒;并且其中因子VIII在保溫后的活性為步驟(a)中所提供活 性的至少25 %。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本申請說明書的一些方面部分地公開了含有脂質(zhì)外套的病毒。完整的病毒顆粒被 稱為病毒粒子，由核酸（或者為DNA、或者為RNA)組成，核酸被蛋白質(zhì)保護(hù)層包圍，該蛋白質(zhì) 保護(hù)層被稱為病毒殼體。病毒可能被分組成非包膜病毒和包膜病毒。這里使用的術(shù)語"含有 脂質(zhì)外套的病毒"指的是任何包含細(xì)胞膜或包括比如脂質(zhì)在內(nèi)的包膜的病毒，比如包膜病 毒。包膜病毒的病毒殼體被脂蛋白細(xì)胞膜、或者包膜包圍。該包膜來源于宿主細(xì)胞，因?yàn)椴?毒由宿主細(xì)胞表面"發(fā)芽"并且該包膜主要由不被病毒基因組編碼的脂質(zhì)組成。盡管其攜帶 有用于附著并進(jìn)入靶細(xì)胞、并且對包膜病毒的傳染性而言必不可少的的分子決定簇，但其 不是抗藥性或者抗原性轉(zhuǎn)變的主體。包膜病毒的尺寸范圍為從大約45-55nm至大約120-200nm?？赡芨腥静溉閯游锛?xì)胞的含有脂質(zhì)外套的病毒包括:DNA病毒，比如皰疹病毒病毒、 痘病毒病毒、或者肝DNA病毒病毒;RNA病毒，比如黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、δ病毒(丁型 肝炎病毒，(161丨&￥；[1'118)、正粘病毒、副粘病毒、彈狀病毒(1']1&6(1〇￥；[1'1(1&6)、本雅病毒、或者 纖絲病毒病毒；以及反向轉(zhuǎn)錄病毒，比如反轉(zhuǎn)錄病毒或肝DNA病毒。含有脂質(zhì)外套的病毒的 非限制性例子包括艾滋病毒、辛德畢斯病毒、單純皰疹病毒、假狂犬病毒、仙臺病毒、水泡性 口膜炎病毒、西尼羅河病毒、牛病毒性腹瀉病毒、冠狀病毒、馬關(guān)節(jié)炎病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜 合癥病毒、莫洛尼鼠白血病毒、或者牛痘病毒。
[0015] 非包膜病毒指的是其病毒殼體缺少脂蛋白細(xì)胞膜、或者包膜的病毒。在非包膜病 毒中，病毒殼體介導(dǎo)著對于宿主細(xì)胞的附著和穿透進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒殼體一般是螺旋狀 或者二十面體狀。非包膜病毒的尺寸范圍為從大約18-26nm至大約70-90nm?？赡芨腥静溉?動物細(xì)胞的非包膜病毒包括，例如，細(xì)小病毒、腺病毒、雙RNA病毒(birnaviridae)、乳頭瘤 病毒、多瘤病毒（polyomaviridae)、小RNA病毒、呼腸孤病毒、以及杯狀病毒 (calciviridae)〇
[0016] 本申請說明書的一些方面部分地公開了包含具有活性的蛋白質(zhì)的液體。液體可以 是任何具有被病毒污染可能性的液體。液體的非限制性例子包括，例如，任何被純化的液 體、被部分地純化的液體、或者粗的液體或者膠體，包括，例如，來自在前提純步驟的洗脫 液;組織提取物和細(xì)胞培養(yǎng)物提取物，比如細(xì)胞裂解液、細(xì)胞上清液、胎盤提取物、或者腹水 液體;生物液體，比如血液、血漿、血清、乳、唾液、精液;或者任何其他的包括具有活性的蛋 白質(zhì)的液體。
[0017] 具有活性的蛋白質(zhì)可以是任何所關(guān)注的蛋白質(zhì)，在其中期望任何污染性病毒活性 被消除。在此公開的蛋白質(zhì)可能是血液蛋白質(zhì)，例如凝血蛋白質(zhì)、白蛋白、和/或免疫球蛋 白。血液蛋白質(zhì)的非限制性例子包括:ADAMTS-13、α 1-抗血纖維蛋白酶、α2_抗血纖維蛋白 酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌癥前凝血劑、促紅細(xì)胞生成素、因子II、因子V、因子VI、因子 VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纖連蛋白、纖維蛋白原、肝素輔 因子II、高分子量激肽原、肌內(nèi)免疫球蛋白、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、纖溶酶 原激活物抑制劑-1、纖溶酶原激活物抑制劑-2、激肽釋放酶原、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、蛋白質(zhì)Ζ、 蛋白質(zhì)Ζ相關(guān)蛋白酶抑制劑、組織因子、組織纖溶酶原激活物、尿激酶、或者馮維勒布蘭特因 子。
[0018] 在此公開的蛋白質(zhì)可以是由可天然地表達(dá)蛋白質(zhì)的生物體得到的蛋白質(zhì)、由通過 基因工程化而表達(dá)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物體得到的蛋白質(zhì)、或者由可通過重組方式生產(chǎn)蛋白 質(zhì)的細(xì)胞系得到的蛋白質(zhì)。生物體的非限制性例子包括鳥和哺乳動物，例如，小鼠、大鼠、山 羊、綿羊、馬、驢、牛、靈長類動物和人。轉(zhuǎn)基因生物體的非限制性的例子包括在此公開的已 經(jīng)通過基因工程化而表達(dá)所關(guān)注蛋白質(zhì)的生物體。來自生物體或者轉(zhuǎn)基因生物體的在此公 開的蛋白質(zhì)可以通過使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的常規(guī)方法由生物液體、組織或者器官提出物、 或者來自生物體的其他來源得到。例如，為了得到血液蛋白質(zhì)，可以在血清分離管中從生物 體或者轉(zhuǎn)基因生物體中抽出全血。該血液允許凝結(jié)，并且凝結(jié)的血液被離心成碎片團(tuán)粒。得 到的血清樣品（即上清液)然后可以被等分并且/或者在-20°C儲存直至需要時。用于血液收 集和血清制品的具體方案的非限制性例子例如在下述文獻(xiàn)中有描述：Di Lorenzo and Stra singer,保健中的血液收集（FA Da vis 公司，2001);以及Diana Gar za&Kathleen Becan-McBride,放血手冊:血液收集精要(Prentice Hall，第6次版,2002)。
[0019] 可選地，也可以使用各種原核表達(dá)系統(tǒng)和/或真核表達(dá)系統(tǒng)，以便通過重組方式表 達(dá)在此公開的蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)可能包括下述多種特征中的任何一種，包括、但不限于:誘 導(dǎo)表達(dá)、非誘導(dǎo)表達(dá)、組成性表達(dá)、組織特異性表達(dá)、細(xì)胞特異性表達(dá)、病毒調(diào)節(jié)的表達(dá)、牢 固整合的表達(dá)、以及瞬時表達(dá)。本技術(shù)領(lǐng)域已知如何產(chǎn)生和使用這樣的表達(dá)系統(tǒng)。
[0020] -般地，編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的多核苷酸被克隆入表達(dá)載體。原核表達(dá)載體典型地 包含復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動子和/或增強(qiáng)子元件、以及核糖體結(jié)合、聚腺苷酸化、轉(zhuǎn)錄終止的 必需位點(diǎn)、以及5 '側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列及其他非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。例舉的原核載體包括使用啟動 子比如噬菌體T7啟動子的pET和pRSET。真核表達(dá)載體典型地包含復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動子 和/或增強(qiáng)子元件、以及核糖體結(jié)合、聚腺苷酸化、拼接、轉(zhuǎn)錄終止的必需位點(diǎn)、以及5 '側(cè)翼 非轉(zhuǎn)錄序列及其他非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。例舉的酵母載體包括使用啟動子比如A0X1、AUG1、GAP、 以及GAL1的pAO、pMET、pPIC、pPICZ、以及pYES。例舉的昆蟲載體包括使用啟動子比如PH、 ?10、]?1^。5、0?比24?64、以及?〇111的？4。5、？84(：、？18、？]\08、？]?1'。例舉的哺乳動物載體包括 pBPV、pCMV、pCMVTNT、pDNA、pDisplay、pMSG、p0G44、pQBI25、pRc/RSV、pSECTag、pSECTag2、 口5643￥2。3伙口5￥1(345￥1^41](：16-]\^1'4￥4)(14虬116〇以及口乂1'1，這些載體使用啟動子比如 酪蛋白、乳球蛋白、乳清酸啟動子、HSV胸苷激酶、早期至晚期猴腎病毒40(SV40)、來自 反向病毒的LTRs、以及小鼠金屬硫蛋白-1。選擇性標(biāo)記包括氨芐青霉素、氯霉素轉(zhuǎn)移酶、卡 那霉素、新霉素、以及四環(huán)素。合適的表達(dá)載體在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的，并且可在市場上買 到。
[0021] 能夠表達(dá)兼容的載體的細(xì)胞包括原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、以及由原核細(xì)胞和真核細(xì) 胞衍生的細(xì)胞系。原核菌株的非限制性的例子包括例如由下述衍生的菌株:大腸桿菌、枯草 桿菌、地衣芽孢桿菌、脆弱擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridia perfringens)、難辨梭狀芽 抱桿菌(Clostridia difficle)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、乳酸乳球菌、脫 甲基桿菌(methylobacterium extorquens)、曼寧奈瑟氏菌屬（Neisseria meningirulls)、 腦膜炎奈瑟氏球菌、熒光極毛桿菌和鼠傷寒沙門氏菌。酵母菌株的非限制性例子包括例如 由下述衍生的酵母菌株:巴斯德畢赤氏酵母、畢赤嗜甲醇酵母(Pichia methanolica)、安格 斯畢赤酵母(Pichia angusta)、粟酒酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母和解脂 耶氏酵母。植物細(xì)胞和由植物衍生的細(xì)胞系包括例如來自下述的細(xì)胞:單子葉植物種類，比 如，錯質(zhì)種玉米;和雙子葉植物種類，比如，阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、小麥、膨脹 浮萍(Lemna gibba)和浮萍。昆蟲細(xì)胞和由昆蟲衍生的細(xì)胞系包括例如來自下述的細(xì)胞:草 地夜蛾（5口0(1(^丨613；1^1^1口61(13)、粉紋夜蛾（1'1'；[011(^111813 11；0、果繩和煙草天蛾 (Manduca sexta)。昆蟲細(xì)胞系的非限制性例子包括High-Five、Kc、施奈德果繩細(xì)胞系2 (S2)、SF9、以及SF21細(xì)胞系。哺乳動物細(xì)胞和由哺乳動物細(xì)胞衍生的細(xì)胞系包括例如來自 下述的細(xì)胞:小鼠、大鼠、倉鼠、豬、牛、馬、靈長類動物和人。哺乳動物細(xì)胞系的非限制性例 子包括：1A3、3T3、6E6、10T1/2、APRT、BALB/3T3、BE(2)-C、BHK、BT、C6、C127、CH0、CHP3、C0S-1、COS-7、CPAE、ESK-4、FB2、GH1、GH3、HeLa、HEK-293、HepG2、HL-60、MR-32、L2、LLC-PK1、L-M、MCF-7、NB4、NBL-6、NCTC、Neuro 2A、NIE-115、NG108-15、NIH3T3、PC12、PK15、SBAC、SH-SY5Y、SK-Hep、SK-N-DZ、SK-N-F1、SK-N-SH、ST、SW-13、以及VV-1 細(xì)胞系。細(xì)胞系可以從美國 典型培養(yǎng)物保藏中心、歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心和/或德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心 得到。
[0022] 在從生物體、轉(zhuǎn)基因生物體、或者細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)初步收集后，在此公開的蛋白質(zhì)可 以經(jīng)受蛋白質(zhì)純化處理。一般來講，蛋白質(zhì)純化包括:將蛋白質(zhì)捕集成更高濃度的形式、中 間提純步驟以便除去雜質(zhì)、高純度水處理(polishing)以便除去額外的雜質(zhì)和蛋白質(zhì)變體。 參見例如下述文獻(xiàn)：蛋白質(zhì)科學(xué)中的當(dāng)前方案（Current Protocols in Protein Science)，"常規(guī)色譜分離"，第8-9章 ，（John Wiley&Sons公司，Hoboken，新澤西州，1995)。 捕集的普通方法包括親和層析、凝膠過濾、沉淀、和/或大小排阻色譜?？捎米髦虚g步驟或者 高純度水處理步驟的工藝包括陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、以 及陶瓷羥基磷灰石色譜、反相HPLC、凝膠過濾、沉淀、滲濾、親和層析、或者色譜聚焦 (chromatofocusing)〇
[0023] 在此公開的方法可以在該純化過程期間任一時間點(diǎn)進(jìn)行。一般來講，當(dāng)在制造工 藝開始、而不是在制造工藝較后期進(jìn)行在此公開的方法時，較大的試劑量和較長的保溫時 間是必需的。這是因?yàn)椋诩庸ら_始階段體積更大，并且產(chǎn)物典型地純度較低。反之，后來雜 質(zhì)已經(jīng)減少，并且產(chǎn)物在大多數(shù)情況下被更好地限定;并且隨著體積減小，純度和效價會更 大;或者其中病毒載量已經(jīng)通過在前純化工序被減少或者減弱。
[0024] 本申請說明書一些方面部分地提供下述步驟:將在此公開的液體與有機(jī)溶劑和表 面活性劑混合，借此產(chǎn)生混合物。液體與有機(jī)溶劑和表面活性劑的混合可以進(jìn)行任何時間 長度，附帶條件是，使用的混合時間可得到使有機(jī)溶劑和表面活性劑與所述液體充分地結(jié) 合的混合物。這種情況下，所述混合應(yīng)該確保：1)有機(jī)溶劑可促進(jìn)在表面活性劑和包封含有 脂質(zhì)外套的病毒