一種膨脹床與吸附樹脂固定床偶聯(lián)提取藻藍(lán)蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物深加工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種膨脹床與吸附樹脂固定床偶 聯(lián)提取藻藍(lán)蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藻藍(lán)蛋白是水溶性的，破壁提取使得其他蛋白質(zhì)等也存在于粗提液中，造成粗提 取液中藻藍(lán)蛋白的純度低，這就導(dǎo)致要增加純化步驟來(lái)提高藻藍(lán)蛋白的純度。目前，研究者 們嘗試了許多簡(jiǎn)單、高效地提高藻藍(lán)蛋白純度的分離純化方法，如多次雙水相萃取結(jié)合法、 雙水相萃取結(jié)合離子交換色譜法、膨脹床吸附結(jié)合傳統(tǒng)的凝膠過(guò)濾和離子交換色譜法、活 性炭和甲殼素吸附處理結(jié)合離子交換色譜法等。
[0003] 大孔吸附樹脂是一類與離子交換樹脂不同的分離材料，能將吸附和篩選性能相結(jié) 合，可用于生物大分子的分離純化中。
[0004] 螺旋藻藻藍(lán)蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍(lán)藻所特有的一種超 分子捕光色素復(fù)合體。藻藍(lán)蛋白色澤呈明亮的藍(lán)色，顏色鮮艷，是食品、高級(jí)眼影、唇膏的首 選純天然色素。藻藍(lán)蛋白還可以調(diào)節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗 氧化、抗炎癥作用，調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍(lán)蛋白帶有很強(qiáng)的 熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷，免疫化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程等研究領(lǐng)域。
[0005] 在我國(guó)，每年的螺旋藻全國(guó)總產(chǎn)量已達(dá)到7000噸。螺旋藻產(chǎn)量的三分之一用于直 接出口，其余螺旋藻多以藻粉、藻片和灌注膠囊的形式當(dāng)作保健品使用。螺旋藻的規(guī)?；_ 發(fā)和利用處于初級(jí)加工階段，還沒(méi)有深加工產(chǎn)品。螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的提取還處于實(shí)驗(yàn)室 研究階段，沒(méi)有適合于工業(yè)化生產(chǎn)的好的工藝方法。目前，市場(chǎng)上銷售的高純度的藻藍(lán)蛋白 商品都是從國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，在應(yīng)用上受到限制。
[0006] 膨脹床吸附是近年出現(xiàn)的一種新型生物分離技術(shù)，具有集成化優(yōu)勢(shì)，可以直接從 含有顆粒的料液中捕獲目標(biāo)產(chǎn)物，集料液澄清、目標(biāo)產(chǎn)物濃縮和分離純化為一體，從而達(dá)到 簡(jiǎn)化操作步驟，提高產(chǎn)品收率，降低生產(chǎn)成本的目的。膨脹床吸附技術(shù)現(xiàn)已成功用于各種未 澄清粗提液中直接捕獲蛋白質(zhì)等生物制品的領(lǐng)域，如E.coli勻漿、酵母發(fā)酵液、哺乳動(dòng)物細(xì) 胞培養(yǎng)液、牛奶和動(dòng)物組織提取物等，也有應(yīng)用在天然產(chǎn)物小分子物質(zhì)分離領(lǐng)域中。膨脹床 兼有固定床和流化床的優(yōu)點(diǎn)和集成化的特點(diǎn)，降低了分離純化的成本，該技術(shù)在藻藍(lán)蛋白 分離純化過(guò)程中的應(yīng)用為實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白生產(chǎn)的規(guī)模化提供了可能。
[0007]目前，缺乏一種純化效率高的膨脹床與吸附樹脂固定床偶聯(lián)提取藻藍(lán)蛋白的方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種純化效率高的膨脹床與吸附樹脂固定床偶聯(lián)提取藻藍(lán) 蛋白的方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:本發(fā)明的一種膨脹床與吸附 樹脂固定床偶聯(lián)提取藻藍(lán)蛋白的方法，包括以下步驟：
[0010]本發(fā)明的一種膨脹床與吸附樹脂固定床偶聯(lián)提取藻藍(lán)蛋白的方法，包括以下步 驟：
[0011] (1)大孔吸附樹脂預(yù)處理；
[0012] (2)大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附去雜蛋白，篩選出目的大孔吸附樹脂；
[0013] (3)制備藻藍(lán)蛋白粗提液:稱取螺旋藻干粉，用反復(fù)凍融法進(jìn)行細(xì)胞破壁，提取藻 監(jiān)蛋白；
[0014] (4)膨脹床吸附分離藻藍(lán)蛋白；
[0015] (5)膨脹床偶聯(lián)ADS-7固定床吸附純化藻藍(lán)蛋白，制得純化的藻藍(lán)蛋白。
[0016] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，先用去離子水洗滌至水中無(wú)渾濁后，用95%乙醇浸泡 24h，再用去離子水洗至無(wú)乙醇味，除去樹脂大孔內(nèi)殘留的溶劑及其它雜質(zhì)，然后用4%鹽酸 浸泡2h，用去離子水洗至中性，再用4%氫氧化鈉浸泡2h，用去離子水洗至中性，抽濾，室溫 晾干至樹脂不相互粘連待用。
[0017] 進(jìn)一步地，在步驟（2)中，稱取大孔吸附樹脂0.15g置于50mL具塞三角瓶中，加入 30mL藻藍(lán)蛋白粗提液，密封，在200rpm/min，25°C下恒溫振蕩吸附3h;
[0018] 吸附后，取上清液，分別測(cè)定280nm、620nm和650nm處的吸光度值，計(jì)算吸附后藻藍(lán) 蛋白的純度和含量，吸附前后總固形物含量和總蛋白含量，計(jì)算大孔吸附樹脂對(duì)總蛋白、藻 藍(lán)蛋白、雜質(zhì)蛋白及固形物雜質(zhì)的吸附容量，篩選出目的大孔吸附樹脂。
[0019] 更進(jìn)一步地，在步驟(3)中，以螺旋藻干粉與磷酸鈉鹽緩沖液的固液比為l:150g/ mL，在-20°C和37°C反復(fù)凍融5次，每次凍融時(shí)間為4h;將凍融5次后的破壁液于5000rpm下離 心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4°C冰箱中儲(chǔ)藏備用。
[0020] 進(jìn)一步地，在步驟(4)中，將吸附劑Streamline DEAE裝入膨脹柱中，打開出水口， 使吸附劑Streamline DEAE均勻沉降，達(dá)到沉降床層高度為H0 = 10.0cm時(shí)，停止加入吸附劑 并關(guān)閉出水口，最后使柱中吸附劑表面上留有l(wèi)cm尚度的溶液；
[0021 ]用蠕動(dòng)栗將平衡緩沖液從膨脹床底部入口栗入柱中，吸附劑Streamline DEAE在 柱中不斷向上移動(dòng)，當(dāng)上升至膨脹床層高度為H = 20.0cm不再上升時(shí)，將頂部調(diào)節(jié)器固定在 床層上l_2cm處，繼續(xù)平衡20-30min，使床層穩(wěn)定；
[0022]待膨脹床穩(wěn)定后，將進(jìn)口流體從平衡緩沖液切換成藻藍(lán)蛋白粗提液，開始進(jìn)樣，整 個(gè)吸附過(guò)程中，控制進(jìn)樣流速，保持膨脹床層的膨脹率穩(wěn)定;用自動(dòng)部分收集器每2min收集 一次流出液;停止進(jìn)樣后，進(jìn)口流體從藻藍(lán)蛋白粗提液切換成平衡緩沖液，進(jìn)行向上沖洗， 去除膨脹床中的雜質(zhì)和弱結(jié)合蛋白。
[0023] 更進(jìn)一步地，在步驟(5)中，在采用Streamline DEAE膨脹床方式分離純化藻藍(lán)蛋 白粗提液之后，收集洗脫下來(lái)的濃縮藻藍(lán)蛋白溶液，再經(jīng)過(guò)ADS-7固定床分離層析，除去溶 液中的雜質(zhì)蛋白，進(jìn)一步提高藻藍(lán)蛋白的純度;采用濕法裝柱，將2.0g ADS-7裝入層析柱 中，打開出水口，讓水流出，當(dāng)液面高于樹脂層表面的l-2cm時(shí)，關(guān)閉出水口；
[0024]用25mM磷酸鈉鹽緩沖溶液平衡柱子；
[0025]連接好恒流栗和自動(dòng)部分收集器，在柱頂加入10 . OmL藻藍(lán)蛋白溶液，所述藻藍(lán)蛋 白的含量為2.1527mg/mL，總蛋白的含量為7.1880mg/mL，藻藍(lán)蛋白的純度為1.00;
[0026] 分別用去離子水、0.5M NaCl和1M NaCl溶液洗脫，洗脫流速為2.0BV/h，流出液收 集頻率為每15min收集一次；
[0027] 分別以4.0BV/h、6.0BV/h、9. OBV/h和12. OBV/h的進(jìn)樣流速將膨脹床純化后的藻藍(lán) 蛋白溶液直接經(jīng)過(guò)ADS-7固定床床層，自動(dòng)部分收集器每一個(gè)床層體積收集一次流出液，流 出液即為純化的藻藍(lán)蛋白。
[0028] 進(jìn)一步地，在步驟(4)中，所述緩沖液為25mM中性磷酸鈉鹽緩沖液。
[0029] 進(jìn)一步地，在步驟(4)中，所述膨脹柱為400mm X 16mm。
[0030] 有益效果:本發(fā)明產(chǎn)率高，縮短操作時(shí)間，降低成本，得到濃縮的、純度較高的目標(biāo) 產(chǎn)物，再生性能好，可重復(fù)使用，適合規(guī)模化生產(chǎn)。膨脹床富集與固定床層析去雜偶聯(lián)方式 是一種快速、有效的分離純化藻藍(lán)蛋白的方法，結(jié)合了膨脹床的集成化優(yōu)點(diǎn)和大孔吸附樹 脂對(duì)雜蛋白的良好吸附性能。
[0031 ] (1)膨脹床吸附技術(shù)是一種集料液澄清、目標(biāo)產(chǎn)物濃縮和分離純化為一體的新型 生物分離技術(shù)，可以作為經(jīng)濟(jì)、高效、適合規(guī)?；a(chǎn)的純化方法，在獲得高產(chǎn)品純度和收 率的同時(shí)也能夠保持產(chǎn)品的生物活性。采用該技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)純化方法可以直接從細(xì)胞破壁 后的藻藍(lán)蛋白溶液中捕獲藻藍(lán)蛋白，大大簡(jiǎn)化操作步驟。
[0032] (2)通過(guò)自制的膨脹床對(duì)螺旋藻藻藍(lán)蛋白的粗提液進(jìn)行分離富集，藻藍(lán)蛋白的純 度(A620nm/A280nm)可由粗提液的0 · 23最高提高至2 · 02，藻藍(lán)蛋白濃度從粗提液的0 · 17mg/ mL提高為2.15mg/mL，膨脹床分離富集藻藍(lán)蛋白的回收率為59.45%。然后，在ADS-7固定床 上對(duì)膨脹床純化樣品進(jìn)行層析去除雜蛋白。在優(yōu)化的條件下，獲得的藻藍(lán)蛋白層析樣品的 藻藍(lán)蛋白純度為2.20，藻藍(lán)蛋白濃度為0.87mg/mL，藻藍(lán)蛋白回收率為58.81 %。整個(gè)偶聯(lián)分 離純化過(guò)程耗時(shí)7. Oh，藻藍(lán)蛋白總回收率為34.96 %。
[0033] (3)粒徑和密度小的吸附劑在膨脹床中的膨脹率高。結(jié)果表明，隨著膨脹床中流體 流速的增加，吸附劑顆粒在膨脹床中的膨脹率增加;在相同流速下，粒徑和密度小的吸附劑 的膨脹率高。大孔樹脂顆粒在相同流速下的膨脹率高，并隨著孔體積的增大而增加。在相同 流速下，大孔樹脂膨脹率高，并隨著孔體積減小，達(dá)到相同膨脹率時(shí)所需的流速增加。
[0034] (4)膨脹床法富集純化;ADS-7大孔樹脂固定床層析除雜蛋白，進(jìn)一步提高純度。膨 脹床-ADS-7固定床偶聯(lián)方式是一種簡(jiǎn)單、快速、適合規(guī)?；a(chǎn)藻藍(lán)蛋白的純化方法，得到 的藻藍(lán)蛋白純度為2.20，較粗提液0.23提高近10倍，整個(gè)過(guò)程共耗時(shí)7h。
【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為ADS-7吸附動(dòng)力學(xué)曲線圖；
[0036] 圖2為離子強(qiáng)度對(duì)ADS-7除雜效果的影響圖；
[0037] 圖3 pH對(duì)ADS-7除雜效果的影響圖；
[0038]圖4 pH對(duì)上清液純度的影響圖；
[0039]圖5固液比對(duì)ADS-7除雜效果的影響圖；
[0040]圖6固液比對(duì)上清液純度的影響圖；
[0041 ]圖7洗脫液中藻藍(lán)蛋白純度隨洗脫體積變化圖；
[0042]圖8藻藍(lán)蛋白洗脫曲線圖；
[0043]圖9雜蛋白洗脫