EDC-BSA的固相載體(酶標(biāo)板）；
[0075] 2)黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度分別為567ng/L、189ng/L、63ng/L、21ng/L、 7ng/L、0ng/L;
[0076] 3)保藏號為CCTCC N0:C201558的雜交瘤細(xì)胞AFB1/3B9分泌的單克隆抗體；
[0077] 4)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體工作液；
[0078] 5)濃縮磷酸鹽緩沖液:恥(：180.(^，腿2?〇4 2.(^，恥2冊〇4.12!12〇29.(^，1((：12.08， 加雙蒸水至l〇〇〇mL;
[0079] 6)濃縮洗滌液：NaCl 80.0g，KH2P〇4 2.0g，Na2HP〇4 · I2H2O 29.0g，KCl 2.0g， Tween205mL，加雙蒸水至 lOOOmL;
[0080] 7)底物液A: 3，3 '，5 '，5-四甲基聯(lián)苯二胺(TMB) 200mg，無水乙醇lOOmL，加雙蒸水至 1000mL；
[0081] 8)底物液8:如2冊〇414.68，梓檬酸9.38,0.75%過氧化氫尿素6.41111^，加雙蒸水至 lOOOmL，調(diào)節(jié) pH至5 · 0~5 · 4;
[0082] 9)終止液：2mo 1 /L硫酸溶液。
[0083] 4.2酶標(biāo)板的制備
[0084] 用包被液將AFB20-EDC-BSA稀釋成0 · 33mg/L，每孔加入100yL，4°C過夜，傾去包被 液，每孔加入250yL洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔加入封閉液250yL，37°C孵育120min，傾 去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用錫箱紙真空密封保存。
[0085] 實施例5酶聯(lián)免疫試劑盒的測定程序
[0086] 5.1試劑的配制
[0087] 1)樣品稀釋液:將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖液用三蒸水稀釋10倍后使用。
[0088] 2)洗滌液:將試劑盒中提供的洗滌液用三蒸水稀釋10倍后使用。
[0089] 3)底物混合液:根據(jù)每次所需用量，將配制的底物液A和底物液B按體積1:1混勻， 現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0090] 5.2樣品前處理：準(zhǔn)確稱取飼料樣品1 ±0.05g于50mL離心管中，加入4mL乙腈、lmL 丙酮，混合均勾，4000r/min離心5min，取上清lmL吹干，加入2mL的PBS溶解。
[0091] 5.3測定步驟
[0092] 1)加樣：向酶標(biāo)板微孔中加入黃曲霉毒素 B1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液50yL， 然后加入單克隆抗體工作液50yL，置于濕盒中，37°C恒溫孵育30min;
[0093] 2)洗滌:倒出孔中的液體，每孔中加入洗滌液250yL洗滌3次并拍干；
[0094] 3)加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體工作液:每孔中加入辣根過氧化 物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體工作液1 OOyL，置于濕盒中，37°C恒溫孵育30min;
[0095] 4)洗滌:倒出孔中的液體，每孔中加入洗滌液250yL，洗滌3次并拍干；
[0096] 5)加底物:每孔中加入底物混合液1 OOyL，置于濕盒中，37°C恒溫孵育15min;
[0097] 6)加終止液:每孔中加入終止液50yL;
[0098] 7)測定:用酶標(biāo)儀在450nm處測定每孔的光密度值(0D值）。
[0099] 5.4結(jié)果判斷 [0100] 標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0101] 以所測定的標(biāo)準(zhǔn)品0D值除以"零"孔0D值(B/Bo)為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素 B1濃度的對 數(shù)值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行線性回歸，給出回歸方程。
[0102] 飼料中黃曲霉毒素 B1的濃度計算：
[0103] 計算樣品的抑制率(所獲得的樣品的0D值除以"零"孔0D值），代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸 方程中，計算出組織中黃曲霉毒素 B1濃度(ng/L)。
[0104] 實施例6本發(fā)明ELISA方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度試驗
[0105] 6.1本發(fā)明試劑盒的靈敏度試驗
[0106] 以標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC5Q值作為本發(fā)明ELI SA方法的靈敏度指標(biāo)。將黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品 稀釋成為567、189、63、21、7、0ng/L6個濃度，每個濃度5個復(fù)孔，按照間接競爭ELISA方法重 復(fù)測定5次，并求測定的IC 5Q值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為方程:y=(A-D)/[l + (x/CrB]+D，A = 0·91763，Β = 7·91097，C= 1.66526，D = 0.08341，R2 = 1 ·00000,其中X=lg(C(AFBi))，Y = B/ BO;IC5〇 = 46.32ng/L，線性范圍 7 ~567ng/L。
[0107] 6.2本發(fā)明試劑盒的精密度試驗
[0108] 將黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成567、189、63、21、7、0ng/L6個濃度，每濃度5個重復(fù)， 按照間接競爭ELISA方法重復(fù)測定5次，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算出各濃度黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定值，計算板內(nèi)和板間變異系數(shù)，結(jié)果見表5。
[0109]表5標(biāo)準(zhǔn)曲線的板內(nèi)與板間變異系數(shù)
[0111] 6.3本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確度、重復(fù)性試驗
[0112] 將黃曲霉毒素 B1添加到飼料樣品中，其添加回收率在60%~120%之間，批內(nèi)與批 間變異系數(shù)< 15% ;具體測定結(jié)果見表6。
[0114] 表6飼料中的添加回收率
[0115]
【主權(quán)項】
1. 一種能識別黃曲霉毒素81、82、61、62的單克隆抗體，其特征在于：它是由保藏號為 CCTCC NO: C201558的雜交瘤細(xì)胞株AFB1/3B9分泌的。2. 權(quán)利要求1中所述的雜交瘤細(xì)胞株AFB1/3B9,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 號為CCTCC N0:C201558。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，它是以黃曲霉毒素 B2與羧甲基羥胺 半鹽酸鹽反應(yīng)后得到的黃曲霉毒素 B2肟與載體蛋白偶聯(lián)后作為免疫原制備得到的。4. 權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體在制備黃曲霉毒素8132、61、62的酶聯(lián)免疫檢測試 劑盒中的應(yīng)用。5. 包含權(quán)利要求1或3所述單克隆抗體的試劑盒。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，該試劑盒是檢測黃曲霉毒素價32、61、62的酶聯(lián)免疫 試劑盒。7. 權(quán)利要求5所述的試劑盒在黃曲霉毒素8132、61、62非診斷目的酶聯(lián)免疫檢測中的 應(yīng)用。8. -種非診斷目的檢測黃曲霉毒素價、82、61、62的酶聯(lián)免疫方法，包括以下步驟： 1) 將黃曲霉毒素 B2肟與載體蛋白偶聯(lián)得到包被原； 2) 用保藏號為CCTCC NO: C201558的雜交瘤細(xì)胞株AFB1/3B9制備單克隆抗體； 3) 用步驟(1)的包被原包被固相載體； 4) 樣品處理:準(zhǔn)確稱取飼料樣品1 ±0.05g于50mL離心管中，加入4mL乙腈、lmL丙酮，混 合均勻，4000r/min離心5min，取上清lmL吹干，加入2mL的roS緩沖液溶解，作為待測樣品溶 液； 5) 對步驟(4)中的待測樣品溶液進行酶聯(lián)免疫檢測。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的特異性單克隆抗體,它是由雜交瘤細(xì)胞株AFB1/3B9所分泌的，所述的雜交瘤細(xì)胞株AFB1/3B9，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC？NO:C201558。本發(fā)明還公開了檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以同時識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2四種毒素，而且具有很高的識別靈敏度，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點。CCTCC NO: C20155820150424
【IPC分類】C12R1/91, C12N5/20, C07K16/14, G01N33/577
【公開號】CN105524168
【申請?zhí)枴緾N201610051042
【發(fā)明人】袁宗輝, 陶燕飛, 彭大鵬, 楊碧嘉, 王玉蓮, 潘源虎, 陳冬梅
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月26日