一種能特異結(jié)合前列腺特異性膜抗原的納米抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱(chēng)納米抗體技術(shù)），以及基因工程抗體技術(shù)，特 別是針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體或多肽。 技術(shù)背景
[0002] 單域抗體是指由普通抗體可變區(qū)（VH或VL)組成的基因工程抗體。單域重鏈抗體 (又稱(chēng)為納米抗體，VHH 抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chain anti body)是指僅由重鏈抗體(heavy-chain antibody)可變區(qū)（Variable region)組成的 基因工程抗體，其中，重鏈抗體(heavy-chain antibody)是一種存在于胳盤(pán)、藍(lán)魚(yú)等動(dòng)物體 內(nèi)天然缺失輕鏈的抗體。單域重鏈抗體是目前已知的最小的完整抗原結(jié)合片段，具有分子 量小、滲透性好等特點(diǎn)，目前已廣泛用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和檢測(cè)、抗體藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。
[0003] 前列腺癌是一種嚴(yán)重威脅老年男性健康的惡性腫瘤，其早期診斷和治療對(duì)于其預(yù) 后具有重要的意義。前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA) 是一種位于前列腺細(xì)胞膜上的II型跨膜糖蛋白，由750個(gè)氨基酸組成，分為胞內(nèi)區(qū)（氨基酸 序列為1-18)、跨膜區(qū)（19-43)和胞外區(qū)（44-750)，相對(duì)于傳統(tǒng)用于臨床檢測(cè)的前列腺特異 抗原(prostate specific antigen，PSA)，是一種更加敏感和特異的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物， 尤其是在激素難治性前列腺癌及前列腺癌轉(zhuǎn)移灶中均為高表達(dá)，在區(qū)分前列腺癌和其他類(lèi) 型惡性腫瘤的敏感度和特異性分別為65.9%和94.5%。另外，在多種非前列腺來(lái)源的實(shí)體 瘤，如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎癌和結(jié)直腸癌等，PSMA也高度特異地表達(dá)于腫瘤血管 內(nèi)皮細(xì)胞上。而且本身具有神經(jīng)羧基肽酶和葉酸水解酶的活性，加之707個(gè)氨基酸組成的胞 外區(qū)能夠提供多個(gè)抗原表位等特點(diǎn)，使其成為了腫瘤免疫靶向治療和分子影像學(xué)中重要的 研究靶點(diǎn)。
[0004] 目前，人們發(fā)現(xiàn)了多種針對(duì)PSMA亦制備了多種能與其發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，包 括單克隆抗體7E11、J591，適體A9和A10，重組技術(shù)得到的ScFv抗體D7、Fab抗體及人源化抗 體的報(bào)道特別是已經(jīng)通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌的診斷和晚期核素治療的lllln-噴地 肽，就是基于針對(duì)PSMA的單克隆抗體與放射性核素相連而成。但與單域重鏈抗體相比，這些 配體存在生產(chǎn)成本相對(duì)較高，制備過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，可以被用于制備 檢測(cè)前列腺特異性膜抗原的試劑和工具。
[0006] 本發(fā)明提供一個(gè)針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體（即本發(fā)明一種能特異 結(jié)合前列腺特異性膜抗原的納米抗體），具有SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列，其氨基酸序 列可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法(ImMunoGeneTics，IMGT)進(jìn)行編號(hào)和結(jié)構(gòu)域的 劃分。
[0007] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含框架區(qū)中的一個(gè)或者兩個(gè)以上的氨 基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸序列具有90 %同源性。
[0008] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含互補(bǔ)決定區(qū)中的一個(gè)或者兩個(gè)以上 的氨基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸序列具有80 %同源性。
[0009] 本發(fā)明提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID N0.: 1，通過(guò)遺傳密碼子可以隨 時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。該核酸分子的序列如SEQ ID N0. :2。
[0010] 本發(fā)明還提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.: 1部分結(jié)構(gòu)域，通過(guò)遺傳 密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。
[0011] 本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過(guò)合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表 達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng) 細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸 序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
[0013] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。
[0014] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)細(xì)胞上前列腺特異性膜抗原的方法，其特征是含有上述蛋 白質(zhì)或多肽。基于本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)或多肽與前列腺特異性膜抗原特異性結(jié)合的能力， 建立前列腺特異性膜抗原的檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)，免疫芯片 法，親和層析法和免疫層析法。
[0015] 本發(fā)明針對(duì)前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體在非疾病診斷治療目的免疫檢測(cè)、 以及菌體或抗原富集純化中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過(guò)隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造， 能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來(lái)發(fā)展進(jìn)一步用于 醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種針對(duì)前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料，包括載體，搭 載在載體上的配基，該材料以針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體作為配基，所述針 對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列。所述載體為 磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
[0018] 本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語(yǔ)具有如下含義：
[0019] 同源性:描述兩個(gè)或更多氨基酸序列的相似程度，第一個(gè)氨基酸序列和第二個(gè)氨 基酸序列之間同源性的百分比可以通過(guò)【第一個(gè)氨基酸序列中與第二個(gè)氨基酸序列中相應(yīng) 位置處的氨基酸序列相同的氨基酸殘基的數(shù)量】除以【第一個(gè)氨基酸序列中氨基酸總數(shù)】在 乘以【100%】來(lái)計(jì)算，其中第二個(gè)氨基酸序列中的某個(gè)氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與 第一個(gè)氨基酸相比）被認(rèn)為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹 配的計(jì)算機(jī)運(yùn)算程序如NCBI Blast獲得。
[0020] 結(jié)構(gòu)域:蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
[0021 ] IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種 已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)（E h r e n m a η，F(xiàn) ·， Q.Kaas，et al.(2010).''IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies ?T cell receptors，MHC， IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res38(Database issue):D301_307.Lefranc，M.P·， C.Pommie，et al · (2003) ·''IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains"Dev comp Immunol 27(1) :55-77.http://www. imgt.org/)中的描述。
[0022] 密碼子(codon):又稱(chēng)為三連體密碼子(triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核 苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。
[0023] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體或多肽具有 與前列腺特異性膜抗原特異性結(jié)合、可以通過(guò)生物學(xué)方法大規(guī)模生產(chǎn)、成本低、高效、分子 量小、滲透性好等性質(zhì)，顯示出良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1菌落PCR產(chǎn)物電泳、重組蛋白電泳和Western Blot鑒定圖。左邊Marker泳道為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1中的菌落PCR片段出現(xiàn)在預(yù)期位置。中間為純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，在預(yù)期位置出現(xiàn)明亮條帶。右邊為以抗PSMA單克隆抗體和抗His標(biāo)簽抗體的 Western Blot鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過(guò)單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，這些 具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 前列腺特異性膜抗原膜外區(qū)的真核表達(dá)
[0028] 采用RNAiso Plus試劑提取高表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞中總RNA，利用RT-PCR方法得 到編碼PSMA胞外區(qū)片段的DNA片段，使用Not I與BamH I兩種限制性?xún)?nèi)切酶將其插入真核表 達(dá)載體pRAG2a，通過(guò)T4DNA連接酶連接為重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞 培養(yǎng)過(guò)夜，將鑒定正確的克隆送測(cè)序驗(yàn)證。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000將DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中培養(yǎng)，于不同時(shí)相點(diǎn)收集上清，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測(cè)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，按照HisTrap FF Crude試劑盒操作純化該蛋白。將純 化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉后，分別加入PSMA抗體和 His抗體，4°C過(guò)夜;漂洗后，加二抗室溫下孵育lh，再次漂洗，加入顯色液進(jìn)行顯影(圖1)。 [0029] 實(shí)施例2
[0030]抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體（即針對(duì)抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗 體)的淘選與鑒定
[0031]采用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫(kù)(為參考文獻(xiàn):〃涂追，許楊， 劉夏，等.駝源天然單域重鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與鑒定[J].中國(guó)生物工程雜志，2011，31 (4): 31 -36."中構(gòu)建的展示文庫(kù)）中淘選針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體。前列腺特異性 膜抗原膜外區(qū)的表達(dá)按照上述的實(shí)施例1進(jìn)行，第一輪淘選時(shí)，采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS， pH7.4)稀釋上述合成的PSMA胞外區(qū)蛋白至150yg/mL (第2-4輪包被濃度分別為100、50、50μ g/mL)，在酶標(biāo)板上每孔加入100yL，4°C包被過(guò)夜。PBST (含0.5 % Tween 20)洗板5次，3 % BSA-PBS在37°C封閉2h，洗板3次，加入與0.5%BSA-PBS孵育過(guò)的噬菌體抗體庫(kù)100yL(約含2 X10nCFU)，37°C孵育lh，用PBST洗板5次(逐輪增加3次），再用PBS洗板10次(逐輪增加5次）。 再以100yL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附的噬菌體(37°C，5min)，用50yLTris-HCl (lmol/L，pH 9.0)中和洗脫物，取10yL用于滴度測(cè)定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。 [0032]經(jīng)過(guò)四輪淘選后采用濃度為5yg/mL的PSMA胞外區(qū)蛋白包被酶標(biāo)板，洗板、封閉同 上。加入擴(kuò)增純化的噬菌體克隆37°C孵育15min，100yL/孔，37°C孵育lh。洗板后加入稀釋度 為1: 5000的HRP-anti-M13抗體，lOOyL/孔，37°C孵育 lh JBST洗板5次，加 TMB工作液lOOyL/ 孔，室溫20min，每孔加入50yL硫酸(濃度為2mol/L)終止反應(yīng)，測(cè)定450nm吸光值。以前一輪 擴(kuò)增的噬菌體抗體庫(kù)直接包被酶標(biāo)板作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS替代噬菌體克隆為空白對(duì)照，用 間接phage-EL ISA法測(cè)定菌體顆粒的結(jié)合