用于檢測甲砜霉素和氟苯尼考的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能識別甲砜霉素和氟 苯尼考的單克隆抗體，以及用于檢測甲砜霉素和氟苯尼考的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)與試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 氟苯尼考和甲砜霉素屬于氯霉素類化合物，氯霉素在可食性動物中作為預(yù)防和治 療藥物使用已經(jīng)有50多年了，然而由于它對人類有著嚴(yán)重的危害，許多國家將氯霉素列為 禁用藥物。因此，就需要有與氯霉素有相似抗菌活性而且對人體又沒有潛在的危害的化合 物來取代氯霉素。氟苯尼考和甲砜霉素主要用于治療牛、家禽和豬呼吸道和腸道感染。雖然 沒有氯霉素毒性強，但是已有報道表明甲砜霉素的使用可引起動物的可逆性貧血，氟苯尼 考有一定的胚胎毒性，中國、美國、日本及歐盟等許多國家和組織都規(guī)定了它們在動物組織 中的最大殘留限量。目前儀器分析的方法已經(jīng)能夠達(dá)到對該類藥物的檢測要求，準(zhǔn)確度和 精密度都很高，但是儀器昂貴、樣品前處理繁瑣、還需要專業(yè)的操作人員。免疫化學(xué)分析法 特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有快速、靈敏度高、操作簡單、適應(yīng)性強等優(yōu)點，適合高通 量樣品篩選，因此對于快速檢測甲砜霉素和氟苯尼考在動物組織中的殘留，ELISA方法更具 優(yōu)勢。
[0003] 酶聯(lián)免疫吸附法是一種簡單、靈敏度高、特異性好的檢測方法，因此得到了廣泛的 應(yīng)用。目前能夠同時檢測甲砜霉素和氟苯尼考的ELISA檢測方法的報道不是很多，大多數(shù)還 是單個藥物的檢測。其中Luo(2011)建立了豬飼料中氟苯尼考和甲砜霉素的殘留檢測方法， 以氟苯尼考為半抗原，采用混合酸酐法合成了完全抗原，制備了多克隆抗體。該方法對氟苯 尼考IC 5Q為1.02yg/L，對甲砜霉素 IC5Q為2.55yg/L，該方法能同時識別氟苯尼考和甲砜霉 素，但是甲砜霉素較氟苯尼考靈敏度低，交叉反應(yīng)率為40%，且該方法制備的為多克隆抗 體。金銀珍等(2012)以氟苯尼考胺為半抗原，采用碳二亞胺法合成免疫原，以甲砜霉素琥珀 酸酐為半抗原，采用活性酯法合成包被原進行檢測，對甲砜霉素的IC 5Q為15yg/L，對氟苯尼 考胺和氟苯尼考的交叉反應(yīng)率分別為10.8%和10.4%，因此該抗體只能檢測甲砜霉素，且 靈敏度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的為：
[0005] (1)提供一種能特異性識別甲砜霉素和氟苯尼考的單克隆抗體；
[0006] (2)提供所述單克隆抗體在制備甲砜霉素和氟苯尼考酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的應(yīng) 用；
[0007] (3)提供一種含有所述單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒；
[0008] (4)提供所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒在甲砜霉素和氟苯尼考藥物殘留非診斷目的檢 測中的應(yīng)用；
[0009] (5)利用該單克隆抗體，建立一種非診斷目的檢測甲砜霉素和氟苯尼考藥物殘留 的ELISA方法。
[0010] 上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0011] -種單克隆抗體，能識別甲砜霉素和氟苯尼考，它是雜交瘤細(xì)胞株TAP/5F4所分泌 的。
[0012] 所述的雜交瘤細(xì)胞株TAP/5F4，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:C201549。
[0013] 所述的單克隆抗體，它是以氟苯尼考胺(FFA)與琥珀酸酐(HS)反應(yīng)后的氟苯尼考 胺半琥珀酸酯(FFA-HS)與載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的。本發(fā)明優(yōu)選 的免疫原載體蛋白是血藍(lán)蛋白（KLH)。
[0014] 所述的單克隆抗體可用于制備檢測甲砜霉素和氟苯尼考的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0015] -種包含所述的單克隆抗體的試劑盒，該試劑盒是檢測甲砜霉素和氟苯尼考藥物 殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0016] 所述的試劑盒可用于甲砜霉素和氟苯尼考藥物殘留非診斷目的的檢測。
[0017] -種甲砜霉素和氟苯尼考藥物殘留的非診斷目的酶聯(lián)免疫檢測方法，包括免疫 原、包被原和抗體的制備，其步驟如下：
[0018] (1)將氟苯尼考胺(FFA)與琥珀酸酐(HS)反應(yīng)后的氟苯尼考胺半琥珀酸酯(FFA-HS)與載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為免疫原；
[0019] (2)將氟苯尼考胺(FFA)與載體蛋白偶聯(lián)得到包被原；
[0020] (3)用步驟（1)的免疫原制備得到保藏號為CCTCC N0:C201549的雜交瘤細(xì)胞株 TAP/5F4；
[0021] (4)用保藏號為CCTCC N0:C201549的雜交瘤細(xì)胞株TAP/5F4制備單克隆抗體；
[0022] (5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；
[0023] (6)樣品的處理和檢測。
[0024] 優(yōu)選地，免疫原載體蛋白是血藍(lán)蛋白（KLH)，包被原載體蛋白是卵清白蛋白（0VA)。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：
[0026] 1、本發(fā)明在抗體制備時，以氟苯尼考胺半琥珀酸酯作為半抗原，將半抗原與載體 蛋白偶聯(lián)作為免疫原，由該免疫原制備的單克隆抗體能特異性地同時識別氟苯尼考和甲砜 霉素。
[0027] 2、本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒和方法適用于檢測動物可食性組織如豬肉、雞肉、魚、 豬肝臟和雞肝臟中的氟苯尼考和甲砜霉素藥物殘留，檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度高，精密度好， ICso 值僅為 0 · 35 ± 0 · 03yg/L。
[0028] 3、本發(fā)明所涉及的檢測方法簡單，易操作，檢測成本低，對操作者身體健康危害相 對較小。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明的單克隆抗體與甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品的間接競爭ELISA反應(yīng)曲線，X軸為 甲砜霉素(TAP)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對數(shù)值，Y軸為甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光密度值除以"零"孔光 密度值(B/Bo)。
【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不限制本發(fā)明。
[0031] 實施例1免疫原和包被原的制備
[0032] 1.3氟苯尼考胺半琥珀酸酯與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物(FFA-HS-KLH)的制備
[0033] 稱取氣苯尼考胺(FFA)247mg( lmmol)，B0C酸酉干218mg( lmmol)，Na2C〇3l06mg( lmmol) 于50mL圓底燒瓶中，加入二氯甲烷10mL，室溫反應(yīng)過夜。過濾，除掉Na2C03,然后加入琥珀酸 酐200mg(2mmol)，三乙胺lmL，60°C油浴條件下，回流反應(yīng)Id。蒸干除掉二氯甲燒，加三氟乙 酸2mL，室溫水浴反應(yīng)2-4h，待反應(yīng)完全滴加三乙胺調(diào)中性，用乙酸乙酯洗滌2-3次，合并有 機相，無水硫酸鎂脫水后，蒸干得到黃色油狀物，即半抗原氟苯尼考胺半琥珀酸酯（FFA-HS)。反應(yīng)式如下：
[0035] 稱取氟苯尼考胺半琥珀酸酯69.4mg，溶于lmL DMF中，加入DCC 60mg和N-羥基琥珀 酰亞胺(NHS)34.6mg，室溫避光反應(yīng)8h，反應(yīng)完全過濾得到A液。取3mL KLH溶于3mL PBS中， 為B液。冰浴條件下，將A液緩慢滴加到B液中，4°C反應(yīng)8-10h。將產(chǎn)物裝入透析袋內(nèi)，4°C條件 下用PBS透析5d，每天更換透析液3次。得到的即為FFA-HS-KLH。
[0037] 1.4氟苯尼考胺卵清白蛋白偶聯(lián)物(FFA-EDC-0VA)的制備
[0038] 稱取氟苯尼考胺24.7mg，溶于100yL DMF中為A液。稱取40mg 0VA溶于6mL PBS中， 為B液。將A液緩慢滴加到B液中，然后加入EDC 16mg和NHS 12mg，室溫反應(yīng)過夜，將反應(yīng)物裝 入透析袋內(nèi)，4°C用透析5d，每天更換透析液3次。得到的即為完全抗原FFA-EDC-OVA。反 應(yīng)式如下：
[0040]實施例2單克隆抗體的制備 [0041 ] 2.1動物免疫
[0042]利用發(fā)明人所在的國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室制備的免疫原（FFA-HS -KLH)免疫 Balb/C小鼠（購自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心）。免疫程序是取含F(xiàn)FA-HS-KLH偶聯(lián)物50 ~l〇〇yg的蛋白溶液與佐劑等量混合后注入小鼠體內(nèi)，使其產(chǎn)生特異性血清。
[0043] 2.2細(xì)胞融合和克隆化
[0044] 參照楊漢春《動物免疫學(xué)》，利用發(fā)明人所在國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室制備的FF-HS-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（購自湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心），免疫程序 為:基礎(chǔ)免疫將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠背部皮下多點注射，以后每 間隔2周加強免疫一次，換用不完全佐劑乳化。最后于融合前三天(最好于免疫結(jié)束后休整1 月）腹腔注射，強化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。
[0045] 融合時，取經(jīng)最后強化免疫的B