植物誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一種植物誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化、干旱等逆境是植物生長、發(fā)育的主要環(huán)境限制因素。植物無法逃避逆 境，只能應(yīng)對。因此，植物演化形成一套感知逆境脅迫、傳導(dǎo)逆境信號，并在分子、細胞和生 理水平上響應(yīng)的精細調(diào)控機制。許多研究表明，各種逆境脅迫作用于植物細胞，不僅在轉(zhuǎn)錄 后水平調(diào)控，還在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，誘導(dǎo)逆境響應(yīng)基因的表達以適應(yīng)環(huán)境。
[0003] 植物誘導(dǎo)型啟動子可以精細調(diào)節(jié)植物在受到外界刺激時基因的表達。誘導(dǎo)型啟動 子的研究一直是植物轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的熱點問題，特別是誘導(dǎo)型啟動子在植物抗逆轉(zhuǎn)基因育 種中作為關(guān)鍵元件備受關(guān)注。目前誘導(dǎo)型啟動子主要集中在生物和非生物脅迫誘導(dǎo)啟動子 方面，包括響應(yīng)干旱、高鹽、高溫、冷害、病害和外源ΑΒΑ脅迫的啟動子，其中一些啟動子已廣 泛應(yīng)用于植物抗逆轉(zhuǎn)基因育種中。例如，擬南芥Rd29啟動子已成功應(yīng)用于抗旱轉(zhuǎn)基因小麥 育種;高鹽、干旱和ΑΒΑ誘導(dǎo)啟動子0sNCED3、Wsil8已應(yīng)用于水稻抗逆轉(zhuǎn)基因育種。盡管目前 已克隆出一些逆境誘導(dǎo)型啟動子，但還是不能滿足不同植物不同轉(zhuǎn)基因育種的要求，仍需 挖掘和研究新的逆境誘導(dǎo)型啟動子。特別是從特殊生境植物克隆逆境誘導(dǎo)啟動子的研究還 是比較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種植物逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動子。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種DNA分子。
[0006] 上述DNA分子是植物HbHAK2啟動子，來源于野大麥（Hordeum brevisubulatum (Trin. )Link)，為如下 1)或2)或3):
[0007] 1)序列表中SEQ ID No.l所示的DNA;
[0008] 2)在高嚴謹條件下與序列表中SEQ ID No.l所示的核苷酸序列雜交且具有啟動子 活性的DNA分子；
[0009] 3)與所述1)或2)的核苷酸序列具有65%以上的同一性，且具有啟動子活性的DNA 分子;具體的，所述同一性為90%以上;再具體的為95%以上;再具體的為96%以上;再具體 的為97%以上;再具體的為98%以上;再具體的為99%以上。
[0010]其中，序列表中的SEQ ID No.l所示的核苷酸序列由744個脫氧核糖核苷酸組成。 [0011]上述高嚴謹條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(〇. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 7%SDS)中，65°C預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 7% SDS，同位素標記的核苷酸片段），65°C雜交12h;棄雜交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸 鈉緩沖液，PH7.2，5 % SDS)，65°C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液Π (20mmol/L磷酸鈉緩沖 液，pH7 · 2，1 % SDS)，65°C洗膜30min。
[0012]本發(fā)明的DNA分子（啟動子活性片段)還包括與序列表中SEQ ID No.l所示的核苷 酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列互補的核苷酸序列。這里使用的術(shù)語"互補的" 系指遵循堿基配對原則產(chǎn)生的之意。
[0013] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的調(diào)控片段的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離 得到的調(diào)控片段的核苷酸序列65%或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表達靶基因的啟 動子活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0014] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的DNA分子的核苷酸序列具有65 %或更高，優(yōu)選地75 %或更高，更優(yōu)選地85 %或更高，甚 至更優(yōu)選地90%或更高，以及最優(yōu)選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉 眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比 (% )表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0015] 為了解決上述問題，本發(fā)明還提供了與上述DNA分子有關(guān)的生物材料，為下述A1)-A6)中的任意一種：
[0016] A1)含有權(quán)利要求1所述DNA分子的表達盒；
[0017] A2)含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體或含有A1)所述表達盒的重組載體；
[0018] A3)含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組微生物、含有A1)所述表達盒的重組微生物 或含有A2)所述重組載體的重組微生物；
[0019] A4)含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組細胞系、含有A1)所述表達盒的重組細胞系 或含有A2)所述重組載體的重組細胞系；
[0020] A5)含有權(quán)利要求1所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、含有A1)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因 植物組織或含有A2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0021] A6)含有權(quán)利要求1所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、含有A1)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因 植物器官或含有A2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0022] 上述表達盒可由所述DNA分子、由DNA分子啟動轉(zhuǎn)錄的目的基因和終止子組成。
[0023] 上述重組載體可為重組克隆載體或重組表達載體。
[0024] 上述重組表達載體可為將上述DNA分子或表達盒構(gòu)建到現(xiàn)有植物表達載體上得 到。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PR0KII、 pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或 pCAMBIAl 391 -Xb (CAMBIA公司）等。
[0025] 所述重組載體具體可為pYBA1121-HbHAK2,是將SEQ ID No.l所示的核苷酸序列插 入到中間載體pYBAl 121的多克隆位點間得到的。
[0026] 上述重組細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官不包括繁殖材料。
[0027] 上述重組微生物可為重組菌或重組病毒。
[0028]本發(fā)明還提供了上述DNA分子在作為啟動子中的應(yīng)用。
[0029] 上述應(yīng)用中，所述啟動子為誘導(dǎo)型啟動子。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述誘導(dǎo)型啟動子具體為逆境脅迫誘導(dǎo)型和/或ΑΒΑ誘導(dǎo)型啟動子。
[0031] 本發(fā)明還提供了上述DNA分子或上述Al)-A3)中任一所述生物材料在植物體內(nèi)啟 動目的基因表達的應(yīng)用。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述表達為誘導(dǎo)表達。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述誘導(dǎo)表達為逆境脅迫誘導(dǎo)表達和/或ΑΒΑ誘導(dǎo)表達。
[0034]本發(fā)明還提供了上述DNA分子或上述Al)-A3)中任一所述生物材料在培育植物品 種中的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明還提供了了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述DNA分子和目的基因?qū)?入植物中，得到所述目的基因受逆境脅迫誘導(dǎo)和/或ΑΒΑ誘導(dǎo)表達的轉(zhuǎn)基因植物。
[0036] 上述方法可以通過重組載體pYBA1121_HbHAK2導(dǎo)入植物中實現(xiàn)的。
[0037] 本申請中，所述逆境脅迫為鹽脅迫和/或干旱脅迫。
[0038] 本申請中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物;所述雙子葉植物具體為十字花 科植物;所述十字花科植物具體為擬南芥;所述單子葉植物可為禾本科植物;所述禾本科植 物具體為野大麥。
[0039] 本發(fā)明通過實驗證明，在NaCl、PEG和ΑΒΑ不同濃度和不同處理時間下，HbHAK2啟動 子均可驅(qū)動⑶S基因的表達;但在不處理(對照）、低溫(4°C)和高溫(42°C)脅迫下，HbHAK2啟 動子不能驅(qū)動GUS基因的表達。表明HbHAK2啟動子是一種新型的誘導(dǎo)型啟動子，在高鹽、干 旱脅迫和ΑΒΑ處理下均具有較強的啟動子活性，可誘導(dǎo)目標基因表達以適應(yīng)環(huán)境。該啟動子 可應(yīng)用于抗逆基因工程載體構(gòu)建、植物抗逆分子機制研究和農(nóng)作物耐鹽、抗旱轉(zhuǎn)基因育種。 為植物的遺傳改造提供了一條經(jīng)濟、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用 空間和市場前景。
【附圖說明】
[0040] 圖1為載體ΡΥΒΑ1121的質(zhì)粒圖譜。
[00411圖2為轉(zhuǎn)pr0HbHAK2:GUS擬南芥和空載體對照株系的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。
[0042] Marker為TRANSlKb(購買自天根生化科技(北京)有限公司）；質(zhì)粒為PCR擴增陽性 對照；1-11為轉(zhuǎn)pr〇HbHAK2: GUS株系;Col為野生型擬南芥;Empty為轉(zhuǎn)空載體對照株系。 [0043] 圖3為轉(zhuǎn)proHbHAK2: GUS擬南芥株系經(jīng)不同處理后的⑶S染色結(jié)果。
[0044] 圖4為經(jīng)不同處理的轉(zhuǎn)proHbHAK2: GUS擬南芥中GUS基因的相對表達量。
【具體實施方式】
[0045]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 野大麥（Hordeum brevisubulatum(Trin. )Link)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲 得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0047] 載體pYBA1121為BioVector質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心(http : // www·biovector .net/product/163197 .html，400-800-2947)產(chǎn)品。
[0048] Hoagland 營養(yǎng)液配方（1L) :0.51g/L KN03、0.82g/L Ca(N03)2、0.49g/L MgS〇4.7H20、0.136g/L KH2P〇4、lmL Fe EDTA溶液和lmL A-Z溶液。其中，F(xiàn)e EDTA溶液配制方 法為：分別溶解7.45g Na2EDTA、5.57g FeS〇4.7H20于200mL蒸餾水中，加熱、不斷攪拌使 Na2EDTA溶液與FeS〇4溶液混合，然后定容至1L;A-Z溶液的配方為：2·80mg/L H3B〇3、0·08mg/ L CuS〇4 · 5H20、0.22mg/L ZnS〇4 · 7H20、81mg/L MgCh · 6H2O和0.09mg/L HM〇0 · 4H20。
[0049] MS培養(yǎng)基配方:4.3g/L MS粉末、20g/L蔗糖、6g/L植物凝膠，pH5.8。
[0050] GUS染液配方：10mmol/L EDTA-Na2、0.5mmol/L K3Fe(CN)6、0.5mmol/L K4Fe(CN)6 · 3H20、lmg/mL X-gluc、0·1 %TritonX-100，pH7·0〇
[00511實施例l、HbHAK2啟動子的獲得 [0052] -、野大麥的培養(yǎng)
[0053] 鹽生牧草-野大麥(Hordeum brevisubulatum(Trin. )Link)，采自內(nèi)蒙古鹽漬化草 原。在室溫條件下，野大麥種子用去離子水浸泡12h后，放入到4°C冰箱中過夜。用滅菌的去 離子水沖洗3遍，放于濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，25°C萌芽。經(jīng)過4-5天待其大部分發(fā)芽之后，轉(zhuǎn) 到滅菌的盛有l(wèi)/2Hoagland培養(yǎng)液的玻璃瓶中（用不透光的紙包住），在溫度22-23°C，光照 強度1000-3000ymol nrS'光照12h/天、黑暗12h/天的條件下生長，待長到兩葉一心時取 材備用。
[0054] 二、HbHAK2啟動子的克隆
[0055]采用CTAB法提取野大麥的基因組DNA，以該DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增引物 如下：
[0056] proHbHAK2-F:5 '-TGAGCTCAAACTCATTCGACATCATGTCG