一種用于造血干細胞分離的適配子及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于造血干細胞分離的適配子及其試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 造血干細胞是指具有自我更新能力并能分化為各種血細胞前體細胞，最終生成各 種血細胞成分，包括紅細胞、白細胞和血小板，它們也可以分化成各種其它細胞。近十多年 來，隨著對造血干細胞的功能認識和研究的不斷深入，造血干細胞移植已成為治療血液病、 惡性腫瘤的有效方法，亦應(yīng)用于治療某些自身免疫性疾病。
[0003] 造血干細胞主要來源于外周血造血干細胞，臍帶血干細胞等地方。然而，正常人外 周血中造血干細胞的含量很低，⑶34+細胞僅占外周血單個核細胞0.01 %~0.1 %，現(xiàn)有方 法還無法對外周血中痕量造血干細胞直接分離和采集。因此，實現(xiàn)人體外周血中造血干細 胞的高效富集，從而為探討造血干細胞在疾病治療方面的作用奠定基礎(chǔ)。同時，臍血分離技 術(shù)是建立臍血庫和進行臍血移植研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接關(guān)系到臍血樣本凍存的終體積、 造血干/祖細胞分離率、細胞凍存復(fù)蘇后的干細胞回收率、細胞的有效活性維持以及下一步 研究的成敗。臍血分離的目的主要是去除臍血中的紅細胞、血小板和部分血漿，收集富含臍 血干/祖細胞的有核細胞(NC)，通過分離使臍血濃縮和純化，提高臍血干/祖細胞的濃度，以 滿足研究和保存的需要。目前臍血分離技術(shù)包括羥乙基淀粉(HES)沉淀法、Percoll溶液密 度梯度離心法、單克隆抗體加流式細胞儀分析法、免疫磁珠分選法或氯化銨溶解法等。 Denning-Kendall等對淋巴細胞液(Ficoll)分離、密度梯度離心分離、NH4C1溶解法、甲基纖 維素法、明膠分離法、羥乙基淀粉(HES)沉降法等不同臍血分離方法的分離效果進行詳細的 分析和比較后認為，3%明膠沉降法的分離效果最好，其CD34+細胞的回收率和集落(CFU-C) 回收率最高，分別達到86%和92%。溶解法次之，但其終體積較大因而實際應(yīng)用價值不大。 Ficoll和Percoll密度梯度離心法，雖然應(yīng)用較廣泛，但其對技術(shù)的要求較高而且費用相對 較貴。而且Ficoll法單次分尚臍血量較小，在分尚血量多的樣本時，使用的尚心管數(shù)多，工 作量大，很容易造成污染，因此不適宜大批量臍血的分離。
[0004] 免疫磁分離技術(shù)是外周血細胞快速分離富集技術(shù)的重要組成部分之一，該技術(shù)可 高效捕獲、濃縮人外周血樣品中靶細胞，提高靶細胞檢測靈敏度。近年來，基于磁性微珠的 免疫磁分離法(ms)將抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對目標(biāo)細胞 進行捕獲、富集，磁分離。然而，目前該基于微米級免疫磁珠的分離技術(shù)存在諸多局限性:1) 微米磁珠的比表面積相對較小，降低了磁珠捕獲效率;2)由于微米磁珠自身的顆粒性質(zhì)，其 與細胞之間通過多相反應(yīng)(multiphase reaction)結(jié)合，通常需要更長的時間去特異性捕 獲食品基質(zhì)中的細胞;3)微米磁珠單分散性較差，在外周血基質(zhì)中容易發(fā)生自身聚集或形 成沉淀;4)傳統(tǒng)的免疫磁分離技術(shù)，往往是將抗體直接偶聯(lián)于免疫磁珠上，此過程常常會導(dǎo) 致抗體的活性大大地降低并且導(dǎo)致抗體的空間方向發(fā)生改變增大了抗體間的空間位阻效 應(yīng)，從而降低了抗體的捕獲效率5)血液粘稠度高并且其中非造血干細胞的血細胞濃度大， 微米磁珠容易產(chǎn)生非特異性吸附，難以實現(xiàn)對血液中造血干細胞特異性分離;6)微米磁珠 的濃度過高會造成造血干細胞的破損(磁場導(dǎo)致細胞表面磁珠互相吸引，使細胞受到擠壓 甚至破裂），導(dǎo)致分離的失敗;7)磁珠偶聯(lián)抗體時，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具 有活性的抗體聯(lián)接在磁珠表面?？贵w與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質(zhì)及其表面殘留的 疏水或強親水基團容易引起抗體空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致抗體生物活性下降。
[0005] 然而無論是免疫磁分離技術(shù)還是羥乙基淀粉(HES)沉淀法、Percoll溶液密度梯度 離心法、單克隆抗體加流式細胞儀分析法、免疫磁珠分選法或氯化銨溶解法等方法，均具有 分離方式復(fù)雜，成本高，時間久的缺點。
[0006] SELEX技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可 以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體。其基本思路是 體外化學(xué)合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗脫未結(jié)合 的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進入下輪 的篩選。通過重復(fù)的篩選與擴增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的 核酸分子被洗去，而與革G物質(zhì)有強未和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分尚出來，且純 度隨SELEX過程的進行而增高，最后占據(jù)庫的大多數(shù)（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先運用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體 后，經(jīng)過十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技術(shù)，篩選特定的結(jié)合造血干細胞的適配體具有較為重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下步驟實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種造血干細胞的核酸適配體序列。
[0009] 本發(fā)明中，所述的造血干細胞的核酸適配體（序列1-25)能夠特異結(jié)合造血干細 胞。
[0010] 本發(fā)明中，所述的造血干細胞選自人外周血造血干細胞。
[0011] 本發(fā)明的進一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對該序 列應(yīng)用，可進一步用于制備特異性分離人造血干細胞的試劑盒。
[0012] 從體外合成的隨機寡聚DNA文庫，5 ' -TCCCTCAAAGCGCACTATTA(N35) ATCATGGACGTGCTAATGAT-3'。中篩選出與造血干細胞特異結(jié)合的核酸適配體;將篩選出的序 列用弓丨物F(5，-FAM_tccctcaaagcgcactatta_3，）和R(5，-biotin_atcattagcacgtccatgat-3'）進行擴增并進行ΤΑ克隆入pMD19-T載體(購自上海博光生物公司），轉(zhuǎn)化DH5a細菌(購自 北京天根生物公司）；挑去白色菌落進行PCR確定陽性克隆后，抽提質(zhì)粒并測序反應(yīng)，上測序 儀測序。
[0013] 本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術(shù)，以人外周血造血干細胞為正篩 靶標(biāo)，以人紅細胞為反篩靶標(biāo)，篩選與造血干細胞特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié) 合造血干細胞的序列，本發(fā)明中命名為適配體ZXST1-ZXST25。序列如下：


[0039] 本發(fā)明的適配子可以用于構(gòu)建試劑盒，該試劑盒可以用于特異性的分離造血干細 胞，具有分離效果快，效率高，節(jié)省時間，節(jié)約