一種用于恩拉霉素微生物效價測定的檢定培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種一種用于恩拉霉素微生物效價測定的檢定培養(yǎng)基，更具體地，本 發(fā)明涉及一種檢定恩拉霉素效價的培養(yǎng)基制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 恩拉霉素，又名恩來霉素、安來霉素、恩霉素、持久霉素，系1966年自日本兵庫縣西 宮市土壤中分離出來的放線菌Streptomyces fungicidious N0.B5477發(fā)酵產(chǎn)生的一種多 肽類抗生素。恩拉霉素是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有 機堿，主要成分為恩拉霉素 A和恩拉霉素 B，還有少量的C和D組分。
[0003] 恩拉霉素具有廣泛的抗革蘭氏陽性菌活性、優(yōu)良的促生長、改善飼料利用率作用 及其低毒低殘留等優(yōu)點，在臨床上常把恩拉霉素作為禽、豬、魚的抗生素促生長劑。恩拉霉 素作為一種新型肽類抗生素，具有廣譜、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，已成為新型抗生素 的來源。
[0004] 目前，恩拉霉素含量測定主要有HPLC法和微生物檢定法(管碟法）APLC測定恩拉 霉素的文獻如ZL 201010226506.6、ZL201010528367.2和ZL 201410105471.9等，用恩拉霉 素 A和恩拉霉素 B作為標準品，雖然HPLC測定恩拉霉素的方法操作相對簡單，但是HPLC測定 恩拉霉素的方法還不是通用標準，國內(nèi)和國際上還是不太認同該方法，同時涉及的HPLC儀 器價格也比較昂貴?，F(xiàn)在我國國家標準和國際上通用的恩拉霉素含量測定標準仍然是微生 物檢定法，可能與恩拉霉素成分復雜，用其中主要成分恩拉霉素 A和恩拉霉素 B標定的HPLC 方法不能夠完全反應出產(chǎn)品的質(zhì)量有關(guān)。
[0005] 在公開的關(guān)于恩拉霉素檢測方法的文獻中，微生物檢定法(管碟法)耗時長，高濃 度和低濃度抑菌圈差異不顯著，檢測范圍受限等缺陷。朱曦等的《恩拉霉素含量測定方法的 改進》通過對樣品提取、緩沖液及終濃度等檢測條件進行優(yōu)化，使改進后標準品高濃度抑菌 圈直徑范圍在18-22_之間，大小圈差異明顯，使得檢測結(jié)果更精準。劉雅妮等的《恩拉霉素 預混劑含量測定方法的改進》將《進口獸藥質(zhì)量標準》檢測方法中pH值4.0的醋酸鹽緩沖液 改為pH值7.8的磷酸鹽緩沖液，將儲備液濃度由1000單位/mL降低為200單位/mL，提取時間 延長至2~3h，對培養(yǎng)基組成、菌濃、緩沖液、樣品提取液和提取時間等檢測條件進行優(yōu)化， 找出抑菌圈大小合適，邊緣清晰的試驗條件，提高了測定的準確性。雖然如此，但是發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的恩拉霉素微生物鑒定法的抑菌圈邊緣模糊的缺陷并沒有沒消除，而測量抑 菌圈直徑是取得試驗結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，抑菌圈的模糊會使的測定誤差大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服管碟法的邊緣不清晰的缺陷，本發(fā)明提供一種恩拉霉素微生物效價測定 的檢定培養(yǎng)基，更具體地，本發(fā)明涉及一種恩拉霉素微生物效價測定的檢定培養(yǎng)基制備方 法，以及新的檢定培養(yǎng)基在恩拉霉素微生物效價測定中的應用。
[0007] 抑菌圈邊緣清晰度是影響測定結(jié)果的主要因素，導致抑菌圈邊緣不清晰的原因有 多種，在抑菌圈形成過程中抗生素的擴散系數(shù)紊亂、不均一，不符合動力學公式中各項之間 的關(guān)系或各擴散系統(tǒng)交叉，如培養(yǎng)基原材料的成分及質(zhì)量、pH值、鹽濃度及培養(yǎng)時間均可影 響抑菌圈邊緣的清晰度;多組分抗生素例如恩拉霉素中，各組分抗菌活性的不同，擴散系數(shù) 也不同，其交叉作用影響抑菌圈邊緣的清晰度。
[0008] -種恩拉霉素檢定培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基按重量計包括蛋白胨5份、肉膏 3-5份、NaCl 18-20份、磷酸氫二鈉2.2-3.5份、瓊脂14份。
[0009] 優(yōu)選的，所述恩拉霉素檢定培養(yǎng)基按重量計包括蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl 20 份、磷酸氫二鈉2.4份、瓊脂14份。
[0010] 優(yōu)選的，所述恩拉霉素檢定培養(yǎng)基pH值為7.8-8.1.
[0011] -種恩拉霉素檢定培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的制備方法包括：（1)稱取蛋白 胨5份、肉膏3-5份、NaCl 18-20份、磷酸氫二鈉2.2-3.5份、瓊脂14份，加蒸餾水使成1000mL 混合物；
[0012] ⑵用6M NaOH試液調(diào)步驟（（1)所述的1000mL混合物pH值，使滅菌后1000mL混合物 的pH值為7.9~8.1，混合物分裝。
[0013] (3)滅菌:將分裝的混合物高壓蒸汽滅菌，貼上標簽備用。
[0014]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的制備方法包括：（1)稱取蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl 20份、 磷酸氫二鈉2.4份、瓊脂14份，加蒸餾水使成1000mL混合物；
[0015] ⑵用6M NaOH試液調(diào)步驟（（1)所述的1000mL混合物pH值，使滅菌后1000mL混合物 的pH值為7.9~8.1，混合物分裝。
[0016] (3)滅菌:將分裝的混合物高壓蒸汽滅菌，貼上標簽備用。
[0017] 發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明使用所述的恩拉霉素檢定培養(yǎng)基培養(yǎng)后得到的抑菌圈 邊緣清晰，無雙圈，無莢膜，抑菌圈直徑適中，大大減少了測定誤差。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明，但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā) 明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下 可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的 保護范圍內(nèi)。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠 商所建議的條件。
[0019] 實施例1 [0020] 1 準備
[0021] 1.1試液的準備
[0022]按照常規(guī)方法制備pH7.8磷酸鹽緩沖液、6m〇VL氫氧化鈉試液、1N鹽酸試液、丙酮-0.1N鹽酸-水混合液、0.1 %新潔爾滅溶液、75%乙醇溶液。
[0023] 1.2檢定培養(yǎng)基的制備
[0024] (1)稱取蛋白胨、肉膏、NaCl、磷酸氫二鈉、瓊脂，加蒸餾水使成1 OOOrnL混合物；
[0025] (2)用6M NaOH試液調(diào)步驟（（1)所述的1000mL混合物pH值，使滅菌后1000mL混合物 的pH值為7.9~8.1，混合物分裝。
[0026] (3)滅菌:將分裝的混合物高壓蒸汽滅菌，貼上標簽備用。
[0027] 1.3平皿的制備
[0028] A、將配制好的檢定培養(yǎng)基加熱溶解。
[0029] B、將培養(yǎng)皿平鋪在水平臺上，用量杯取培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中呈水平狀擴散，放置使 之凝固作底層。
[0030] C、底層所需培養(yǎng)基作菌層培養(yǎng)基并保溫在水浴鍋中。用時取出，待冷卻后往菌層 培養(yǎng)基里加試驗菌懸液，充分混合。
[0031] D、在上述盛有底層培養(yǎng)基的平板中，分別加入試驗菌懸液的菌層培養(yǎng)基5mL。用陶 瓦蓋蓋上，放置備用。
[0032] 1.4接種物的制備(枯草芽孢桿菌CMCC53501，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）
[0033] A、將接種好的增殖培養(yǎng)基斜面的茄子瓶倒過來，在36±1°C的電熱恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)7天。
[0034] B、培養(yǎng)結(jié)束后，從電熱恒溫培養(yǎng)箱中取出，取一支加滅菌水約40mL，從培養(yǎng)基的斜 面洗下菌苔制成芽孢懸液，并倒回至滅菌大試管中。
[0035] C、將大試管放進65±1°C的電熱恒溫水浴鍋里，加熱30分鐘待冷后放入冰箱（1~ l〇°C)貯藏，這稱為枯草芽孢桿菌菌懸液，保存期限為3個月。
[0036] 2.儀器設備TOMY ES215高壓蒸汽滅菌鍋;干燥箱;恒溫培養(yǎng)箱;ZY-300IV多功能微 生物自動測量分析儀，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。
[0037] 3.恩拉霉素樣品效價測定
[0038] A、吸取適量對照品儲備液（1000ug/mL)，用PH7.8磷酸鹽緩沖液精確定量稀釋，配 制成低稀釋度（高濃度)40u/mL的恩拉霉素對照品溶液和高稀釋度(低濃度）10u/mL的恩拉 霉素對照品溶液
[0039] D、按前面方法制備好平皿，把鋼圈放置在平板上，每個平板均一地放置4個鋼圈。
[0040] E、點樣:每份取8張平板，往平板上相對的2個鋼圈中注入對照品稀釋液(40u/mL)， 其它2個鋼圈中注入對照品稀釋液(10u/mL)。
[0041 ] F、培養(yǎng):在36 ± 1°C的隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)16-18小時。
[0042] G、培養(yǎng)結(jié)束后，從培養(yǎng)箱里取出平板，拆下鋼圈。
[0043] 步驟1.2中檢定培養(yǎng)基的組分如下表1所示：
[0044] 表1:檢定培養(yǎng)基組分
[0046]實驗結(jié)果：培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基5的平皿，產(chǎn)生的抑菌圈邊緣模糊或不整齊，產(chǎn)生雙 圈，與菌層反差不夠明顯;培養(yǎng)基3的抑菌圈呈現(xiàn)心形或橢圓形，抑菌圈邊界比培養(yǎng)基2和培 養(yǎng)基5的抑菌圈邊緣清楚，但是仍然可以看到雙圈，與菌層反差比比培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基5的得 到改善;培養(yǎng)基4的高濃度和低濃度抑菌圈直徑差異不大，并且邊緣模糊，不利于測量;培養(yǎng) 基1平皿上的抑菌圈邊緣比培養(yǎng)2-5都清楚，無雙圈，無莢膜，并且抑菌圈性狀為規(guī)則的圓 形，抑菌圈直徑適中，高低濃度的抑菌圈差異較大?；诖藢嶒灲Y(jié)果發(fā)明人將在培養(yǎng)基1的 基礎上進行進一步的精密實驗，以找出更加合適的恩拉霉素檢定培養(yǎng)基成分配方。
[0047] 實施例2
[0048]按照實施例1的步驟1和2準備實驗。另外，為了找出更加合適的恩拉霉素檢定培養(yǎng) 基成分配方，發(fā)明人根據(jù)實施例1中培養(yǎng)基1成分配方進行了調(diào)整。
[0049]按照實施例1的步驟1和2完成準備實驗后，按照以下步驟進行操作：
[0050] A、吸取適量對照品儲備液（1000ug/mL)，用PH7.8緩沖液精確定量稀釋，配制成低 稀釋度(高濃度)40u/mL的恩拉霉素對照品溶液和高稀釋度(低濃度）1 Ou/mL的恩拉霉素對 照品溶液
[0051] B、稱量:精密地稱取恩拉霉素預混劑樣品適量于具塞三角瓶中（共6個）。
[0052] C、溶解與稀釋：用酸式滴