一種基于QTL-seq發(fā)掘東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于QTL-Seq發(fā)掘東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 冷害是水稻生產(chǎn)的主要災(zāi)害之一，是影響早春季節(jié)和高煒度地區(qū)水稻生長發(fā)育的 重要限制因素。當遇上l〇_15°C以下的寒潮天氣，輕者導(dǎo)致水稻秧苗黃化，生長遲鈍;重者導(dǎo) 致爛秧、爛芽和死苗等現(xiàn)象，嚴重影響早稻生產(chǎn)。全世界每年大約有100萬hm 2水稻在不同生 長時期遭受寒害和冷害。因此，水稻耐冷性已成為新時期育種學(xué)家普遍關(guān)注的課題，并認為 選用避冷、耐冷品種是解決水稻冷害的最有效辦法。
[0003] 東鄉(xiāng)野生稻是迄今全世界分布最北的普通野生稻，是江西特有的野生資源，素有 植物中的'大熊貓'之稱。具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、強耐冷、抗旱、抗多種病蟲害等優(yōu)良特性，而其中 最突出就是耐冷性。據(jù)報道，東鄉(xiāng)野生稻地下莖能耐受-12.8°C低溫，且苗期耐冷性特強，比 粳稻高1個等級。因此，如何更好地保護和發(fā)掘這一強耐冷野生稻種資源具有深遠的理論和 實踐意義。
[0004] 水稻耐冷性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳機理及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制非常復(fù) 雜，通過傳統(tǒng)育種手段挖掘和利用近緣野生種耐冷基因的效率非常低。近年來，隨著分子生 物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，為將多個數(shù)量性狀位點(Quantitative Traits Loci，QTL)分解成單個可操縱的孟德爾因子提供了強有力的手段和途徑。它的基本 原理是依據(jù)連鎖遺傳規(guī)律，借助分子標記對每個個體基因型分類，分析使用的作圖群體中 每個個體的基因型與目標性狀的表現(xiàn)型之間的關(guān)系，從而預(yù)測目標性狀的QTL位點與分子 標記的遺傳連鎖關(guān)系及遺傳距離。
[0005] 傳統(tǒng)的QTL定位方法需要依賴于作圖群體的構(gòu)建以及分子標記的發(fā)展，這個過程 周期長，工作量大，這些嚴重制約了 QTL定位的效率和準確性。高通量測序是對傳統(tǒng)測序一 次革命性的改變，可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。隨著測序成本的降 低以及生物信息學(xué)的發(fā)展，將高通量測序與混合分組分析(Bulked Segregant Analysis， BSA)法相結(jié)合對數(shù)量性狀進行快速定位，找到了 一種通用方便易于操作的對數(shù)量性狀進行 定位的新方法一一QTL-seq。該技術(shù)是對BSA混池進行高通量測序，檢測常用作圖群體如RIL 群體或F2群體中極端分離混池的差異SNP標記，分析預(yù)測差異SNP標記連鎖的候選基因，具 有快速、準確定位數(shù)量性狀等優(yōu)點，在黃瓜、擬南芥等作物中都已成功應(yīng)用。本發(fā)明利用該 技術(shù)探明和發(fā)掘東鄉(xiāng)野生稻中的耐冷基因，為全面闡明東鄉(xiāng)野生稻耐冷性狀的遺傳機理提 供有力證據(jù);為東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因的克隆、功能分析奠定基礎(chǔ)，促進東鄉(xiāng)野生稻耐冷用于 育種實踐，加速東鄉(xiāng)野生稻有利基因挖掘的分子育種進程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于QTL-Seq發(fā)掘東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因的方法，本發(fā) 明利用該技術(shù)探明和發(fā)掘東鄉(xiāng)野生稻中的耐冷基因，為全面闡明東鄉(xiāng)野生稻耐冷性狀的遺 傳機理提供有力證據(jù);為東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因的克隆、功能分析奠定基礎(chǔ)，促進東鄉(xiāng)野生稻 耐冷用于育種實踐，加速東鄉(xiāng)野生稻有利基因挖掘的分子育種進程。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的： (1) 耐冷性狀極端分離混合基因池的構(gòu)建：以栽培稻'協(xié)青早B '為受體親本為母本，東 鄉(xiāng)野生稻為父本進行遠緣雜交，經(jīng)回交和連續(xù)自交獲得重組自交系BQFn)，對BQFn)進行耐 冷鑒定獲得20個強耐冷株系，20個冷敏感株系。分別收集各株系等量的新鮮葉片，將強耐冷 株系等量混合組成耐冷基因池，簡稱R池;將冷敏感株系株系等量混合組成冷敏感基因池， 簡稱S池。用CTAB法提取兩個混池的基因組DNA，用瓊脂糖電泳的方法檢測混池 DNA的濃度。 技術(shù)指標:R池的活苗率80%以上，S池的活苗率低于20%，DNA濃度和純度達到基因組文庫構(gòu) 建要求； (2) 基因組文庫構(gòu)建:檢測合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度為 350 bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加 A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫的構(gòu) 建。隨后先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至lng/ul，再使用Agilent 2100對文庫的 insert size進行檢測，insert size符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準 確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求 進行分型后采用Illumina HiSeq 2500進行測序。技術(shù)指標:文庫有效濃度>2nM; (3) 高通量測序:采用Illumina HiSeqTM2500/Miseq?測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng) CA SAVA堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，我們稱之為Raw D a t a或Raw Re a d s，結(jié)果以 FASTQ文件格式存儲，其中包含各測序reads的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。本次 測序R池產(chǎn)生的Raw data為10.933 G，過濾后的Clean data 10.785G;S池的Raw data為 11.153 G，過濾后的Clean data 11.019 G的數(shù)據(jù)量，Q20 >= 94.3%、Q30 >= 89.4%，GC含量 在42.77%-45.06%之間。表明本發(fā)明的所有樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠大，測序質(zhì)量合格，GC分 布正常，建庫測序成功。技術(shù)指標:每個樣品的raw data測序量不低于10 G，GC含量需在35-65%正常范圍內(nèi)，Q2q>85%; (4) SNP標記的過濾及SNP-index圖的繪制：將R池和S池測序獲得的序列與極端耐冷親 本東鄉(xiāng)野生稻的基因組序列進行比對，獲得兩個混池子代與親本間的SNP標記1，290,297 個，計算兩混池的3即-111(161。3即-111(161是指某個3即位點含有3即的代 &(18數(shù)占該位點所有 reads數(shù)的比例。某位點的堿基完全與東鄉(xiāng)野生稻完全相同時的SNP-index為0;完全與其不 同時的SNP-index為1。過濾掉可靠性不高的SNP標記。最后繪制成耐冷池和冷敏感池的SNP-index 圖譜。技術(shù)指標 :過濾掉兩個子代中 SNP-index 都小于 0.3,并且 SNP 深度都小于 7 的 SNP 位點，另外還過濾掉任何一個混池中SNPindex缺失的SNP位點； (5) 兩極端混池的Δ (SNP-index)計算及其圖譜繪制：按照繪制SNP-index圖的方法繪 制兩極端混池的Δ (SNP-index)圖譜，其中Δ (SNP-index)是耐冷池和冷敏感池中每個SNP 標記的SNP-index的差值； (6) 耐冷候選SNP標記的篩選及耐冷性狀的定位:選取99%置信水平作為篩選的閾值，分 析兩個子代SNP-index差異顯著的區(qū)域，進行1000次置換檢驗。挑選冷敏感S池中SNP-index 接近1，并且耐冷R池的SNP-index接近0的位點，符合這些特點的區(qū)域就可能為與耐冷性狀 相關(guān)的QTL位點。結(jié)果在99%置信水平下發(fā)現(xiàn)候選區(qū)域主要位于12號染色體上，在該區(qū)域共 挑選出2,333個SNP標記。對于12號染色體上的2,333個候選的多態(tài)性標記位點，提取 ANNOVAR的注釋結(jié)果。其中有24個SNP非同義突變位點位于基因上，1個在stop loss上，涉及 17個基因。在其他染色體上276個SNP位點，涉及9個基因。技術(shù)指標:99%置信水平作為篩選 的閾值，Δ (SNP-index)接近1; (7)熒光定量PCR鑒定:參照Invitrogen公司的TRIZ0L試劑使用說明書分別提取東鄉(xiāng) 野生稻和協(xié)青早B的總RNA，同時參照Promega公司的Frist-Strand Synthesis of cDNA試 劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)候選SNP標記所涉及基因的編碼序列，利用Primer 3.0在線設(shè)計 熒光定量PCR引物。以水稻肌動蛋白Actiη基因作為內(nèi)標檢測基因，檢測候選基因的在親本 之間的表達量。熒光定量PCR分析表明，有5個基因在親本之間表達差異明顯，實驗重復(fù)好。 這5個基因分別是8號染色體上的0s08CR，9號染色體上的0S09CR，以及12號染色體上的 0S12CR-l，0S12CR-2和0S12CR-3。技術(shù)指標：熒光定量PCR重復(fù)性好，親本間的差異表達穩(wěn) 定。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明利用該技術(shù)快速準確地鑒定了東鄉(xiāng)野生稻中5個耐 冷相關(guān)基因，具有高效準確、周期短、工作量小等優(yōu)點。本發(fā)明結(jié)果可為全面闡明東鄉(xiāng)野生 稻耐冷性狀的遺傳機理提供有力的證據(jù)，為東鄉(xiāng)野生稻耐冷的克隆、功能分析奠定基礎(chǔ)，促 進東鄉(xiāng)野生稻耐冷用于育種實踐，加速東鄉(xiāng)野生稻有利基因挖掘的分子育種進程。
【附圖說明】
[0009] 圖1為極端耐冷混合基因池冷處理后的表現(xiàn)，各株系成活率80%以上。
[0010] 圖2為極端冷敏感混合基因混池冷處理后的表現(xiàn)，各株系基本死亡。
[0011] 圖3為耐冷池 SNP-index圖譜，縱坐標為平均SNP-index值，橫坐標為各染色體序 號及物理位置，圖中的曲線為耐冷R池中不同染色體位置上對應(yīng)的SNP-index值。
[0012] 圖4冷敏感池的SNP-index圖譜，縱坐標為平均SNP-index值，橫坐標為各染色體 序號及物理位置，圖中的曲線為冷敏感S池中不同染色體位置上對應(yīng)的SNP-index值。
[0013] 圖5各條染色體的Δ (SNP-index)圖譜，是耐冷池和冷敏感池中每個SNP的SNP-index 的差值 。圖譜的縱坐標是 Δ (SNP-index) ， 橫坐標為各條染色體序號及物理位置，圖中 的曲線為不同染色體位置上對應(yīng)的Δ (SNP-index)值。Δ (SNP-index)接近1的區(qū)域表明有 耐冷的候選基因。
【具體實施方式】
[0014] 下面將結(jié)合附圖1-5來詳細說明本發(fā)明所具有的有益效果，旨在幫助閱 讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，但不能對本發(fā)明的實施和保護范圍構(gòu)成任何限定。
[0015] (1)極端分離混合基因池的構(gòu)建：以東鄉(xiāng)野生稻為供體親本，與栽培稻"協(xié)青早B" 雜交獲得種間雜種FiA代與協(xié)青早B回交獲得群體，經(jīng)單粒傳的連續(xù)自交獲得BQFnj 群體。以活苗率為耐冷鑒定指標。活苗率=(活苗數(shù)/總苗數(shù)）Χ1〇〇%。在3葉1心期對B&Fkj群 體進行耐冷處理(8±1°C處理7 d)，隨后在25°C條件下恢復(fù)生長7d，考察B&Fkj群體的活苗 率，實驗重復(fù)3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)野生稻的活苗率為100%，協(xié)青早B的活苗率為17.14%，229個 BILs群體活苗率范圍為0%~96.16%，平均活苗率為21.59%，最后獲得20個活苗率大于80%的 耐冷株系(參見圖1)，20個活苗率為0的冷敏感株系(參見圖2); (2)極端基因混池及其雙親的基因組文庫構(gòu)建:將耐冷株系、冷敏感株系及其雙親播種 發(fā)芽。待所有材料在長至三葉一心時期取幼嫩的葉片，將強耐冷株系等量混合組成耐冷基 因池，簡稱R池;將冷敏感株系株系等量混合組成冷敏感基因池。簡稱S池。用CTAB法提取兩 個混池及其雙親的基因組DNA，用瓊脂糖電泳的方法檢測混池 DNA的濃度和純度。檢測合格 的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度為350bp左右的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加 A 尾、加測序