熒光定量pcr對鮐魚中腐敗微生物的檢測法及所用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種適用于鮐魚貯藏過程中腐敗微生物的熒光定量PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 始魚(Pneumatophorus japonicus)，解形目，鯖科，始屬。又名：青花魚，在我國各 海域均有生產(chǎn)，以東海產(chǎn)量為多。繼大小黃魚、墨魚、帶魚資源銳減以后，鮐魚因其分布廣、 生長快、產(chǎn)量高已成我國近年主要經(jīng)濟(jì)魚類之一。鮐魚含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪等多種營 養(yǎng)，鮮食時味美，加工出來的咸品和干品也相當(dāng)可口。但是食后發(fā)生過敏性食物中毒者卻屢 見不鮮，尤其是食用鮮度較差的鮮魚，則更易發(fā)生中毒。對于食用鮐魚引起的中毒問題，國 內(nèi)外的學(xué)者曾進(jìn)行過較長時間的研討，大多數(shù)認(rèn)為：引起中毒的原因是鮐魚含有的組胺所 致。當(dāng)魚體變質(zhì)或鮮度較差時，細(xì)菌大量繁殖，可使魚體內(nèi)組胺酸脫羧基而形成組胺。在鮐 魚的貯藏過程中，常見的腐敗相關(guān)微生物有希瓦氏菌、弧菌、李斯特菌等。
[0003] 如何經(jīng)濟(jì)有效地延長鮐魚的貨架期，從而擴(kuò)大銷售半徑，是目前鮐魚冷藏、貯藏產(chǎn) 業(yè)鏈面臨的一個主要問題。國內(nèi)外對冷藏魚類貨架期研究表明，新鮮魚類貨架期受魚種類、 大小、生理狀況及貯藏條件等多種因素影響，冷藏期間不同種類的魚品質(zhì)變化規(guī)律不同，貨 架期也有很大差異。若能正確處理原料魚，采用冰藏及冷卻鏈流通可以有效延長貨架期。
[0004] 目前，鮐魚腐敗菌的檢測常采用微生物平板計數(shù)法:分離，提純菌種，再進(jìn)行菌落 生理生化鑒定是一個比較繁瑣的過程，存在檢測周期長，工作量大的缺點(diǎn)，不能適應(yīng)快速檢 測的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢 測法及所用的特異性引物，采用本發(fā)明的方法可輕易判斷鮐魚的新鮮度。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢 測法中所用的特異性引物，該特異性引物由以下至少任意一種組成：
[0007] 表 1

[0010] 上述序列（hdc 基因）：D=G/A/T，Y = C/T，M=A/C，H=A/T/C，R=A/G。
[0011] 本發(fā)明還同時提供了一種熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法，依次 進(jìn)行以下步驟：
[0012] 1)、作為待測樣品的始魚進(jìn)行DNA的提??；
[0013] 2)、設(shè)計熒光定量PCR中的特異性引物，設(shè)置(優(yōu)化)熒光定量PCR體系；
[0014] 3)、以基因組DNA(步驟1)所得DNA)為擴(kuò)增模板，用上述特異性引物，進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增;從而檢測鮐魚中的腐敗微生物。
[0015] 作為本發(fā)明的熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法的改進(jìn):所述特異 性引物如上表1所述。
[0016] 作為本發(fā)明的熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0017] 所述步驟2)熒光定量PCR擴(kuò)增體系為：20yL總體積中含有SYBER Green Ex Taq(2 X ) 1 OyL，上下游引物（1 ΟμΜ)各0 · 4yL，DNA模板(濃度為 1 · 287 X 1 oVg/yL~1 · 200 X 1 oVg/μ 〇1.(^1^，補(bǔ)水至2(^匕
[0018] 備注說明：上述上下游引物如表1所述。
[0019] 作為本發(fā)明的熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0020] 所述步驟2)熒光定量PCR反應(yīng)程序：
[0021 ] 95°〇預(yù)變性3〇86〇;95°〇變性586〇，60°〇退火并延伸3186〇，40個循環(huán)，在每個循環(huán) 的60°C退火并延伸階段收集熒光信號。
[0022] 作為本發(fā)明的熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法的進(jìn)一步改進(jìn):根 據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)中的特異性擴(kuò)增曲線與對應(yīng)的閾值進(jìn)行判斷；
[0023] 檢測基因無特異性擴(kuò)增曲線產(chǎn)生且Ct值2 35者，判定結(jié)果為陰性，即樣品中未檢 出該基因所對應(yīng)的微生物;Ct值小于35者，可判定該樣品結(jié)果為陽性，即樣品中能檢出該基 因所對應(yīng)的微生物。
[0024] 作為本發(fā)明的熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0025] 當(dāng)1?1(3、切^4111、丨111六這4種基因的(^均大于27.5(-般為27.5〈(^〈35)，判定該鮐 魚屬于新鮮(即，處于高品質(zhì)期）；
[0026] 當(dāng)任一基因的Ct< 27.5時，判定該鮐魚已變質(zhì)（即鮐魚已經(jīng)不新鮮，品質(zhì)已經(jīng)嚴(yán)重 變化）。
[0027] 作為本發(fā)明的熒光定量PCR技術(shù)對鮐魚中腐敗微生物的檢測法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0028] 步驟1)中，DNA的提取采用Axygen基因組DNA小量提取試劑盒。
[0029]在本發(fā)明中，始魚樣品菌液采用Axygen基因組DNA小量提取試劑盒。DNA濃度及純 度通過ND-2000C核酸蛋白分析儀檢測。
[0030] 本發(fā)明使用熒光定量PCR技術(shù)，利用該技術(shù)靈敏準(zhǔn)確的特性，分別檢測鮐魚樣品 (或者貯藏過程中的鮐魚樣品）產(chǎn)組胺菌的hdc基因、希瓦式氏菌的tora基因、弧菌的tlh基 因和李斯特菌的inlA基因，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算其拷貝數(shù)來定量檢測產(chǎn)組胺菌、希瓦 氏菌、弧菌和李斯特菌在鮐魚貯藏過程中的生長模型，旨在為檢測鮐魚新鮮度提供參考。
[0031] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0032] 1)、分別在4°C、15°C和25°C溫度條件下貯藏鮐魚樣品并進(jìn)行鮐魚樣品鮮度實(shí)驗(yàn)、 平板微生物計數(shù)和微生物基因組DNA的提?。?br>[0033] 2)、熒光定量PCR中擴(kuò)增引物(特異性引物）的設(shè)計(如表1所述），熒光定量PCR體系 的優(yōu)化；
[0034] 3)、普通PCR擴(kuò)增hdc、tora、tlh和inlA基因，PCR產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒，測序并驗(yàn)證；
[0035] 4)、以質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作各檢測基因的9?光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0036] 5)、利用所建立的熒光定量PCR體系，檢測鮐魚樣品中腐敗微生物。并將熒光PCR的 結(jié)果與鮮度評定及平板微生物計數(shù)相結(jié)合，推算鮐魚的新鮮度。
[0037] 具體如下：
[0038]步驟1)所述的分別在4°C、15°C和25°C溫度條件下貯藏鮐魚樣品并進(jìn)行鮐魚樣品 鮮度實(shí)驗(yàn)、平板微生物計數(shù)和微生物基因組DNA的提取的方法為:將待測的鮐魚樣品先采用 GB/T18108-2008的方法取樣后分三組貯藏，分別放置于高精度低溫培養(yǎng)箱中控制溫度(4土 0.1) °C、（ 15 ± 0.1) °C和(25 ± 0.1) °C貯藏(4°C是冰鮮貯藏溫度，15°C是常溫貯藏溫度，25°C 是高溫貯藏溫度）。由5名評價員組成鮮度評定小組，根據(jù)鮐魚鮮度評價表，以魚體表、氣味、 鰓、肌肉、肉味為主要評價指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)行鮮度評定。根據(jù)鮮度小組的評定結(jié)果，分別在貯藏 在(4± 0.1)°C、（ 15 ±0.1)°C和（25 ±0.1)°C條件下的鮐魚樣品貯藏48h、12h和6h后，在無菌 條件下取鮐魚背部肌肉l〇g置于90mL生理鹽水中，搖勻后靜置5分鐘，根據(jù)GB/4789.2-2010 取樣品懸濁液，在鐵瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板微生物計數(shù)。另取500yL樣品懸濁液接種到5mL的 液體肉湯培養(yǎng)基中，30°C、150r/min搖床培養(yǎng)微生物菌液3h。培養(yǎng)的菌液根據(jù)細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒(康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司）步驟提取基因組DNA。
[0039] 步驟2)所述的熒光定量PCR中擴(kuò)增引物的設(shè)計，焚光定量PCR體系的優(yōu)化方法為： 根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)與報道及NCBI數(shù)據(jù)庫中這4種基因的序列信息，經(jīng)DNAstar軟件的MegAlign 功能比對，篩選出合理的目的片段基因后導(dǎo)入Primer premier 5.0進(jìn)行上述4種基因特異 性引物的設(shè)計。以上設(shè)計的引物和探針序列均委托Sangon Biotech(上海，中國）公司合成。
[0040] 所述的4種基因的特異性引物如表1所述。
[0041 ] SYBER Green I嵌合熒光染料反應(yīng)體系：總體積20yL，SYBER Green Ex Taq(2X ) 1 OyL，正向引物0 · 4yL，反向引物0 · 4yL，ddH208 · 2yL，DNA lyL。
[0042] 熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C30s，然后95°C5s，60°C31s，40個循環(huán)。在每個循 環(huán)的