鑒定大麥糯性性狀的特異性引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳學領(lǐng)域，特別是涉及鑒定大麥糯性性狀的特異性引物及方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為世界上第四大糧食作物，大麥(Hordeum vulgare L.，2n=14，HH)主要用于麥 芽制作、啤酒釀造及動物飼料，少部分被人類用來直接食用。近些年，大麥作為一種由人類 直接食用的糧食作物而受到人們的廣泛關(guān)注。大麥淀粉由20-30%的直鏈和70-80%的支鏈 淀粉組成。糯淀粉含有很少甚至不含直鏈淀粉（1-13% )。大麥胚乳中的直鏈淀粉和支鏈淀 粉比例決定著淀粉的糊化和凝膠化等特性，這些特性進一步?jīng)Q定諸如麥芽、食品和飼料等 質(zhì)量品質(zhì)。高直鏈淀粉不僅可以用作具有應(yīng)用價值的'抗性淀粉'，還可用作膠黏劑、波紋紙 板及紙張的生產(chǎn)。直鏈淀粉的合成僅由6OKDa的顆粒結(jié)合淀粉合成酶I (granu 1 e-bound starch synthase I，GBSS I，又叫waxy蛋白）控制，而編碼該蛋白的單拷貝基因叫waxy基 因。
[0003] Waxy突變體(又叫糯大麥)具有少量或者無直鏈淀粉含量，而造成這種表型的原因 可能是waxy基因表達或者GBSS I蛋白功能出現(xiàn)了紊亂。懦大麥相比一般大麥口感顯著改善 了糯的特性從而使加工的食品口感更脆，有利于開發(fā)休閑食品。糯性也對大麥生產(chǎn)高麥芽 糖糖漿有利。糯大麥淀粉膠凝溫度低，因此烹調(diào)中可以減少養(yǎng)分的流失。糯性淀粉持水能力 強，凝沉和老化速度慢，具有天然的抗老化性能和較強的凍融穩(wěn)定性，因此大大增加了大麥 制品的保鮮能力，適宜制作冷藏及速凍食品，在商業(yè)銷售過程中延長食品的貨架壽命。糯大 麥所表現(xiàn)出的獨特加工特性，在食品開發(fā)上顯示出巨大利用潛力，正日漸成為研究重點。傳 統(tǒng)方法上，選育具有特異性狀的品種，都是基于表型而進行的，鑒定結(jié)果可靠性不高，且費 時費力。因此有必要對大麥糯性性狀的分子機制進行深入研究，提供一種快速準確的糯性 性狀大麥的鑒定檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的在于提供鑒定大麥糯性性狀的特異性引物。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的在于提供糯性性狀大麥的鑒定檢測方法。
[0006] 為達到本發(fā)明的第一個目的，發(fā)明人對糯大麥的分子機制進行了深入的研究，研 究發(fā)現(xiàn)，大麥waxy基因啟動子區(qū)部分片段的缺失可能引起大麥糯性性狀的改變，因此發(fā)明 人從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得糯大麥和野生型大麥waxy基因序列，并對基因序列結(jié)構(gòu)進行分析。 本發(fā)明通過對懦大麥和野生型大麥waxy基因序列（三個懦大麥waxy基因登錄號分別為： GU599883、JQ768365、JQ768364;兩個野生型大麥waxy基因登錄號分別為：GU599884、 JQ768363)進行序列比對分析，在糯大麥基因起始密碼子ATG上游44bp和lOllbp處，設(shè)計了 一對鑒定大麥糯性性狀的特異性引物waxy-p，所述特異性引物的核苷酸序列為：
[0007] 正向引物：5'-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3'（SEQ ID N0.1);
[0008] 反向引物：5'-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3'（SEQ ID N0.2)。
[0009] 利用本發(fā)明所提供的特異性引物可以通過PCR方法對大麥waxy基因的特定區(qū)段進 行PCR擴增獲得擴增片段，若待測大麥具有糯性性狀，那么擴增片段的長度為760bp左右，若 待測大麥具有非糯性性狀，那么擴增片段的長度為970bp左右。
[0010]本發(fā)明進一步的提供了所述的特異性引物在大麥種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明還提供了所述的特異性引物在大麥育種中的應(yīng)用。
[0012] 將利用本發(fā)明所提供的方法鑒定得到的糯大麥與其他各方面表現(xiàn)優(yōu)異的本地大 麥雜交，可以選育兼具糯性和優(yōu)良性狀的大麥
[0013] 本發(fā)明所述的特異性引物還可應(yīng)用于大麥特異材料創(chuàng)制。
[0014] 含有上述特異性引物的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述試劑盒中還可以包 括本領(lǐng)域常用的PCR反應(yīng)試劑。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種鑒定大麥糯性性狀的方法，所述方法包括，以待測大麥基因 組DNA為模板，利用上述特異性引物進行PCR擴增獲得擴增片段，檢測擴增片段的長度，當擴 增片段的長度為760bp時鑒定待測大麥具有糯性性狀，當擴增片段的長度為970bp時鑒定待 測大麥不具有糯性性狀。
[0016] 其中，所述PCR擴增的反應(yīng)程序為：94~95°C預(yù)變性5~8min;94~95°C變性45~ 60s，60~63°C退火40~50s，71~73°C延伸40~50s，共30~35個循環(huán)；71~74°C終延伸4~ 6min〇
[0017] 優(yōu)選的，所述PCR方法的反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性45s，60°C退火 45s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)；72°C終延伸5min。
[0018] 其中，所述PCR擴增的反應(yīng)體系為：5yL 10XPCR buffer、1.5UEx TaqTM DNA聚合 酶、2mmol/l MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng，100ng模板DNA、雙蒸水加至總量 為50yL。
[0019] 在所述方法中，當擴增片段的長度為970bp時，鑒定待測大麥為非糯性大麥。
[0020] 本發(fā)明中對于檢測擴增片段長度的方法沒有特別的限制，可以利用本領(lǐng)域常規(guī)的 方法進行，例如可以利用核酸電泳方法或測序方法鑒定擴增片段的長度。
[0021] 本發(fā)明的一個方面還提供了所述的引物在大麥waxy基因型鑒定中的應(yīng)用，包括利 用所述的特異性引物進行PCR擴增獲得擴增片段，檢測擴增片段的長度，當擴增片段的長度 為760bp時鑒定待測大麥的waxy基因為糯性基因型，當擴增片段的長度為970bp時鑒定待測 大麥的waxy基因為非糯性基因型或者不具有糯性基因型。
[0022] 本發(fā)明所開發(fā)的特異性引物的靶序列為共顯性標記，可以用于鑒定大麥是否為糯 大麥，檢測方便、擴增穩(wěn)定、簡單易行。可以直接對雜交后代材料進行目的基因的擴增檢測， 不但能從基因分子水平上對雜交后代的真假做出判斷，而且在連續(xù)的自交與回交育種過程 中能夠追蹤檢測基因的轉(zhuǎn)移與存在，并且鑒定方法簡單，結(jié)果可靠，彌補了形態(tài)學鑒定的粗 放，利用本發(fā)明的鑒定方法，將使后續(xù)研究更具目的性與針對性，對選育兼具其他優(yōu)良品質(zhì) 的糯大麥具有重要作用。
【附圖說明】
[0023]圖1為三種糯