一種用于蚋類昆蟲分類和鑒定的引物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于蚋類昆蟲(黑蠅)分類和鑒定的 引物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蚋蟲，屬雙翅目長角亞目蚋科(Simulidae)，俗稱黑繩(blackf ly)、盤背(挖背）和 刨錛。古代又稱螨，是醫(yī)學(xué)昆蟲中呈世界性分布的一個(gè)重要類群。它不但騷擾吸血，侵襲人 畜，而且是人類和禽畜類多種疾病的傳播媒介，其中包括人盤尾絲蟲病(Onchocerciasis)、 畜類盤尾絲蟲病和由歐氏曼森線蟲(Mansoneila Ozzanli)引起的曼森絲蟲病及禽鳥住白 細(xì)胞蟲病(Leucocytozoonsis)等疾病。由于蚋具群舞習(xí)性，成群地在人頭部飛行騷擾，可引 起人情緒波動(dòng)，表現(xiàn)為煩躁不安、易激怒等。由于蚋類個(gè)體較小且種間形態(tài)差異較小，在昆 蟲分類界是分類學(xué)一大挑戰(zhàn)，形態(tài)分類局限于國內(nèi)極少數(shù)專家，不能全面快速地進(jìn)行種類 鑒別，對(duì)是否攜帶河盲癥、盤尾絲蟲病原的蚋的分布也不能做出識(shí)別，不能有效地做出預(yù)警 與分析，不能對(duì)防治措施的有效制定提供基本信息及數(shù)據(jù)。
[0003 ] 現(xiàn)有針對(duì)蚋類昆蟲（黑蠅)分類和鑒定的引物如C0I等在種間表現(xiàn)良好但在種下表 現(xiàn)較差，其他引物如ND4，ITS等也存在應(yīng)用范圍有限，使用效果較差，操作比較繁瑣等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于蚋類昆蟲（黑蠅）分類和鑒定的引物及其制備方 法和應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有針對(duì)蚋類昆蟲(黑蠅)分類和鑒定的引物，應(yīng)用范圍有限，使用效果 較差，操作繁瑣的問題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種用于蚋類昆蟲分類和鑒定的引物，所述用于蚋類昆蟲 分類和鑒定的引物序列：
[0006] SEQ ID N0：1 TATGTACTACCATGAGGACAAATATC
[0007] SEQ ID NO：2 AGCAAATAAAAAATATCATTC〇
[0008] 進(jìn)一步，所述用于蚋類昆蟲分類和鑒定的引物片段370bp。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述用于蚋類昆蟲分類和鑒定的引物的制備方 法，所述制備方法包括以下步驟：
[0010]步驟一，總DNA的提取，采用試劑盒法，用100yL洗脫液溶解提取的樣品，采用核酸 滴定儀測定提取DNA的濃度及純度，進(jìn)行樣品檢測或者置于-20°C保存、備用；
[0011] 步驟二，引物篩選，選出備選上游引物13條，下游引物13條，引物序列SEQ ID N0:1 與SEQ ID NO :2的組合；
[0012]步驟三，以所得基因組DNA為模板，利用上述兩對(duì)引物對(duì)基因組DNA中的線粒體 cytb基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013]步驟四，取適量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測結(jié)果，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外 燈下觀察，兩對(duì)引物擴(kuò)增的片段大小分別為400bp，將得到的特異性產(chǎn)物測序，利用 Chromas2.4軟件讀取測序結(jié)果。
[0014] 進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)體系和條件為：PCR反應(yīng)體系為25yL，含2XPCR Master mixl2.5yL，正/反向引物各3yL，DNA模板2yL，含20~50ng DNA，ddH20補(bǔ)足25yL;
[0015] PCR反應(yīng)條件為:94°C下預(yù)變性2min;而后35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30s， 41-51°C 退火 30s，72°C 延伸 30s;最后 72°C 延伸 5min。
[0016] 進(jìn)一步，所述蚋類分子鑒定引物的使用方法，使用1%瓊脂糖電泳檢測。
[0017] 本發(fā)明提供的用于蚋類昆蟲(黑蠅)分類和鑒定的引物及其制備方法和應(yīng)用，引物 cytb組合來自于Chris Simonl994,上下游為自己組合，在現(xiàn)有技術(shù)中引物未被使用也未被 應(yīng)用于蚋類昆蟲（黑蠅）分類中去，未見相關(guān)蚋類昆蟲（黑蠅）鑒定文章使用過此引物;本發(fā) 明的引物片段約370bp，易擴(kuò)增，在不同種間的表現(xiàn)良好，相較其他引物，對(duì)于種下分化的表 現(xiàn)要優(yōu)異一些;比應(yīng)用于蚋類昆蟲(黑蠅）的其他cytb引物比要適用范圍更廣。
[0018] 本發(fā)明運(yùn)用此引物技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有：
[0019] 1、結(jié)果準(zhǔn)確可靠：已經(jīng)對(duì)采自中國的8種蚋蟲進(jìn)行鑒定驗(yàn)證，結(jié)果的可靠性具有充 分的保證。
[0020] 2、操作簡便:應(yīng)用本發(fā)明方法，鑒定蚋類昆蟲，一般的普通實(shí)驗(yàn)人員即可完成，不 需要專業(yè)的形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)。
[0021] 3、實(shí)用性好:本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的引物，可用于蚋類幼蟲、蛹、成蟲的鑒定，只要獲得 蟲體的任何一部分即可鑒定，對(duì)樣本質(zhì)量無要求，可以用于害蟲的準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)報(bào)，還可以有 關(guān)檢疫口岸對(duì)進(jìn)出口醫(yī)學(xué)傳病蚋類的檢測。
[0022] 4、鑒別蚋類昆蟲的引物能夠擴(kuò)增蚋的線粒體cytb基因，為蚋科昆蟲的鑒別提供簡 便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決區(qū)分蚋科不同種昆蟲的難題為今后蚋的生物學(xué)、種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測以 及綜合防治奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的用于鑒定蚋類昆蟲(黑蠅)的引物制備方法流程圖。 [0024]圖2為本發(fā)明所鑒定的蚋的cytb基因擴(kuò)增結(jié)果示意圖；
[0025] 其中，第一列為DL2000mark，其余:窄足真蚋（1-3)力行維蚋(4-6)淡額蚋(7-9)后 克蚋屬（10-12)馬維蚋（13-15)新月紡蚋（16-18)莊氏短蚋（19-21)紅頭厭蚋(22-24)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例的用于鑒定蚋類昆蟲（黑蠅)的引物序列SEQ ID N0:1。
[0028]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的用于鑒定蚋類昆蟲（黑蠅）的分子鑒定引物及使用方 法包括以下步驟：
[0029] S101:總DNA的提取，采用試劑盒法，用100yL洗脫液溶解提取的樣品，采用核酸滴 定儀測定提取DNA的濃度及純度，進(jìn)行樣品檢測或者置于-20°C保存、備用；
[0030] S102:引物篩選，選出備選上游引物13條，下游引物13條，引物序列SEQ ID NO: 1與 SEQ ID NO :2的組合；
[0031] S103:以所得基因組DNA為模板，利用上述兩對(duì)引物對(duì)基因組DNA中的線粒體cytb 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0032] S104:取適量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測結(jié)果，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈 下觀察，兩對(duì)引物擴(kuò)增的片段大小分別為4