反映男性精子活力的精漿piRNA標(biāo)志物或其組合及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及反映男性精子活力的精漿piRNA標(biāo)志物或其組合 及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 不孕不育已成為全世界范圍內(nèi)的生殖健康問題。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全世界約有 1.86億人被不孕不育問題困擾，其中由于男性因素造成的不育占據(jù)一半左右，且近幾年呈 上升趨勢（1)。近75%的男性不育患者被診斷為先天性自發(fā)，然而造成男性不育的分子機制 尚不清晰（2)。目前臨床生殖實驗室檢查項目一般包括對精液的生化檢查，酸性磷酸酶、乳 酸脫氫酶-X等酶類檢查以及精液免疫學(xué)檢查，但這些技術(shù)都存在一定缺陷，不能直接反映 睪丸的生精功能和全面評價精液質(zhì)量，也無法解釋造成男性不育的分子機制(3)。弱精癥是 男性不育疾病中的一種，弱精癥是指精液參數(shù)中前向運動的精子(a和b級）小于50 %或a級 運動的精子小于25 %的病癥，弱精子癥又稱精子活力低下。然而臨床上針對這種疾病的檢 測很難精確反映男性精子的活力程度，難以直接判定精子活力的低下程度及其導(dǎo)致的男性 不育。由于精子活力在男性生殖中起到至關(guān)重要的作用，所以目前急需尋找一種比現(xiàn)有方 法更精確的方法來直接反映精子活力。
[0003] PiRNA是2006年在動物生精細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類新型小分子非編碼RNA，因為它們特 異性地與PIWI蛋白質(zhì)相互作用，所以被命名為PIWI互作RNA(PIWI-interacting RNA)，簡稱 piRNAGlhpiRNA與生殖密切相關(guān)，這不僅因為piRNA特異性的在生殖世系細(xì)胞中高表達， 而且piRNA參與了精子的形成和調(diào)控，包括對精子成熟相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及對逆 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進行抑制等等(4,8)。因此，piRNA突變失去功能后，常常會導(dǎo)致個體不育(9)。
[0004] 因此，通過對這些PiRNA進行研究，有望發(fā)現(xiàn)一些與男性生殖功能（如精子活力等） 密切相關(guān)的PiRNA，以其作為生物標(biāo)志物將有望開發(fā)出反映男性精子活力的指標(biāo)，從而應(yīng)用 于男性生殖功能障礙的臨床診斷、預(yù)測和篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是篩查反映男性精子活力的精漿piRNA，通過測量精漿piRNA特異性 變化，篩選出精子活力弱的生殖功能障礙的男性的精漿PiRNA譜圖，然后通過數(shù)學(xué)分析方法 計算危險系數(shù)評分(Risk Score)以及區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)(Cut-off Value)，從而給每個病人打分并 評估其危險系數(shù)(高危險系數(shù)代表精子活力弱并伴隨生殖功能障礙），最終為精確定量男性 精子活力程度及鑒別因精子活力低下導(dǎo)致的弱精癥提供新的渠道和指標(biāo)。精漿PiRNA作為 新的反映男性精子活力的生物標(biāo)志物具有重要的指導(dǎo)意義，能顯示出分子水平的遺傳信 息，有助于揭示男性精子活力降低的分子機制。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0007] -種與男性精子活力弱及生殖功能障礙相關(guān)的piRNA標(biāo)志物或其組合，包括下列 piRNA中的任意一種或幾種:DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661。其中所述的男性生 殖功能障礙選自弱精癥。
[0009] 本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān)的piRNA標(biāo)志物或其組合在制備檢測男性精子 活力的試劑中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān)的piRNA標(biāo)志物或其組合在制備弱精癥診斷試 劑中的應(yīng)用。
[0011] 定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān)的piRNA標(biāo)志物或其組合的試劑在制 備檢測男性精子活力的試劑中的應(yīng)用;所述的定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān) 的piRNA標(biāo)志物或其組合的試劑優(yōu)選所述的與男性精子活力相關(guān)的piRNA標(biāo)志物或其組合 的TaqMan探針和引物。
[0012] 定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān)的piRNA標(biāo)志物或其組合的試劑在制 備弱精癥診斷試劑中的應(yīng)用;所述的定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān)的PiRNA 標(biāo)志物或其組合的試劑優(yōu)選本發(fā)明所述的與男性精子活力相關(guān)的PiRNA標(biāo)志物或其組合的 TaqMan探針和引物。
[0013] -種用于檢測男性精子活力的試劑盒，包含TaqMan探針實時熒光定量PCR法檢測 DQ570956、DQ571813、DQ575659 和 DQ575661 的探針和引物。
[0014] 一種用于診斷男性弱精癥的試劑盒，包含TaqMan探針實時熒光定量PCR法檢測 DQ570956、DQ571813、DQ575659 和 DQ575661 的探針和引物。
[0015] -種預(yù)測弱精癥的方法，包含以下步驟：
[0016] (1)收集精漿樣本，包括精子活力正常的有生育能力的男性以及精子活力弱的生 殖功能障礙的男性的精漿樣本，并提取總RNA;
[0017] (2)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaqMan探針實時熒光定量PCR法對DQ570956、DQ571813、 DQ575659和DQ575661四種piRNA進行檢測，測算出精子活力低下患者與正常生育男性精漿 中四種piRNA的絕對含量；
[0018] (3)經(jīng)數(shù)學(xué)分析過程計算Risk Score從而評估精子活力與piRNA表達水平之間的 關(guān)系，使用的公式如下：
[0019] Risk Scorei= Znj=iffj · Sij
[0020] 在以上公式中，每個PiRNA的"s"是以正常對照組5%的下限為參考值，即低于正常 5%下限記為1，否則為0。"Sij"是piRNA j相對于sample i獲得的數(shù)值，"W/'是piRNA j的加 權(quán)值。通過以上公式，即可以給病人i打分，獲得其危險系數(shù)評分Risk Sc〇rei。然后根據(jù)ROC 曲線找到一個合適的Cut-off值，然后使用該Cut-off值來評估男性不育與piRNA表達水平 之間的關(guān)系，并評估每個受測試樣本的危險性，從而評估男性精子活力，進而特異性檢測或 預(yù)測弱精癥男性生殖功能障礙疾病。
[0021] 該方法中，將計算得到的Risk Scorei分值與Cut-off值比較，分值大于Cut-off值 提示該樣本危險系數(shù)高，精子活力不足，該樣本來源的男子患有弱精癥;分值小于Cut-off 值提示該樣本危險系數(shù)低，精子活力正常，該樣本來源的男子未患弱精癥。
[0022]本發(fā)明使用的檢測方法選自：TaqMan探針實時熒光定量PCR法，包括以下步驟： [0023] (1)使用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取精衆(zhòng)總RNA;
[0024] (2)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA;
[0025] (3)根據(jù)人piRNA序列設(shè)計引物及TaqMan探針，進行PCR反應(yīng)對piRNA進行精確定量 檢測；
[0026] (4)測算出精子活力低下患者與正常生育男性精漿中四種piRNA的絕對含量。
[0027]本發(fā)明所述的用于檢測相應(yīng)piRNA的TaqMan探針和引物是商業(yè)化購買。目前針對 已知piRNA設(shè)計TaqMan探針和引物已是非常成熟的現(xiàn)有技術(shù)，凡是能夠準(zhǔn)確檢測本發(fā)明所 述的p i RNA的TaqMan探針和引物均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 本發(fā)明精漿piRNA組合及危險系數(shù)數(shù)學(xué)計算方法可應(yīng)用于男性精子活力評估和生 殖功能障礙檢測，例如為男性生殖功能障礙補充新的檢測指標(biāo)，用于病程監(jiān)測、預(yù)后和藥效 評價等。
[0029] 本發(fā)明具有以下幾個方面的有益效果：
[0030] 第一，精漿相對其它組織較易獲得，與睪丸活檢或者睪丸穿刺相比，屬于無創(chuàng)性檢 查，極大地方便了醫(yī)療人員的使用，減輕了患者的痛苦；
[0031] 第二，精漿中的piRNA反映的是整個生精過程中的病理和生理狀況，其檢測結(jié)果更 具有臨床指導(dǎo)意義；
[0032]第三，精漿piRNA檢測能在分子水平上反映精子發(fā)生中的狀態(tài)，提高了檢測的準(zhǔn)確 水平，并為男性生殖功能障礙尤其是生精功能障礙的治療提供了潛在靶點；
[0033]第四，危險系數(shù)數(shù)學(xué)計算方法給每個受試者計算了一個數(shù)值，通過該數(shù)值可以直 接、直觀的反映精子活力程度，避免了主觀因素及經(jīng)驗欠缺等造成的干擾。
[0034]綜上所述，檢測精漿中的piRNA，簡單易行且效果優(yōu)越，從精漿piRNA的特異性變化 這一新角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)精子活力評價標(biāo)準(zhǔn)并且區(qū)分男性生殖功能障礙，從而建立起一種檢 測生精功能障礙的新技術(shù)。本發(fā)明提供的特異性的PiRNA組合與精子活力密切相關(guān)，通過其 含量測算出的危險系數(shù)評分與精子活力負(fù)相關(guān)，能作為男性因精子活力弱導(dǎo)致生殖功能障 礙的分子標(biāo)志物，具有很高的特異性和靈敏性。該技術(shù)僅僅需要病人的精漿而不需要任何 其它組織，通過簡單的精漿PiRNA組合及數(shù)學(xué)計算評估男性精子活力強弱及預(yù)測生殖功能 障礙發(fā)生的可能性。由此可見，檢測精漿piRNA水平能評估精子活力及由精子活力引起的男 性生殖功能障礙，精漿PiRNA的水平有望成為反映男性精子活力的重要標(biāo)志分子，具有極重 要的臨床應(yīng)用潛力和價值。
【附圖說明】
[0035]圖1.本發(fā)明的主要流程圖。
[0036]圖 2.了39]\&111探針實時熒光定量？〇?法測定口丨1?熟(00570956、00571813、00575659和 DQ575661)在弱精患者與正常對照精漿樣本中的濃度及差異性變化。如圖所示DQ570956、 DQ571813、DQ575659和DQ575661在弱精患者精漿中相對正常對照均出現(xiàn)顯著降低，因此 DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661是可以反映精子活力與區(qū)分正常對照和弱精癥 的特異性生物標(biāo)志物P iRNA。
[0037] 圖3.Risk Score分析。首先，對這四種piRNA在正常組和弱精組中表達差異作出 R0C曲線，選擇Cut-off值，算出Risk Score值，然后分析Risk Score與年齡、精子密度、精液 體積、精子活力等臨床信息的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Risk Score與精子活力成反比例關(guān)系，和其 他二種臨床?目息不成比例關(guān)系。
【具體實施方式】
[0038] 以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0039]本發(fā)明通過研究男性因精子活力而造成生殖功能障礙過程中精漿piRNA的特異變 化，篩選出在疾病及正常生理狀態(tài)下表達差異顯著的一組精漿piRNA，將它們的探針應(yīng)用于 男性精子活力檢測，以提高診斷男性精子活力的準(zhǔn)確性。以下實施例中使用的檢測相應(yīng) piRNA的TaqMan探針和引物是由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計制定。試劑盒名稱為 Hairpin-it? Real-Time PCR，訂單號為探10122。但這些探針和引物僅是為了更好的說明 本發(fā)明的技術(shù)方案，不能因此限制本發(fā)明的保護范圍。凡是能夠準(zhǔn)確檢測本發(fā)明所述的 p i RNA的TaqMan探針和引物均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0040] 實施例1 :TaqMan探針實時熒光定量PCR法測定piRNA在精漿中的絕對濃度
[0041] (1)研究對象為結(jié)婚后未采取任何避孕措施2年內(nèi)不育者，以年齡匹配的已育不超 過兩年的男性為正常對照，所有受試者禁欲3~5天后留取精液，用WLJY-9000偉力彩色精子 質(zhì)量檢測系統(tǒng)(北京偉力公司)進行精子質(zhì)量和功能分析。分析標(biāo)準(zhǔn)均按世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn) 進行(WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊第5版）。待精液分析后將其1000g離心10min，收 集上清，再12000g離心5min，收集上清精楽；。
[0042] (2)收集弱精不育者共20例(無前列腺疾病、性功能障礙、精索靜脈曲張、生殖道感 染等病史，患者病程1~7年），以年齡匹配的生育能力正常的男性16例作對照，組成初篩組。 利用Trizol試劑（Invitrogen公司）分別提取100yL單個樣本精衆(zhòng)中的總RNA。針對 DQ570956、DQ571813、DQ575